基因內含子遺傳變異與鴨蛋殼品質關聯(lián)性分析

譚光輝 李杰章 吳磊 覃媛鈺 張依裕

摘要：

Ca2+調控基因ITPR

2是細胞內一種重要的配體門控，鈣離子跨膜轉運活性的關鍵調控因子，影響鈣蛋殼的品質，對ITPR

2基因多態(tài)性與蛋殼品質間的關聯(lián)性角度進行深入探究，旨在為利用該基因指導蛋鴨的遺傳育種提供參考。本文以三穗鴨（Anas platyrhyncha domestica）為材料，采用常規(guī)PCR、直接測序等方法篩查ITPR2基因多態(tài)性。結果顯示：在ITPR2基因中共發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，分別處于內含子10的g128643840 G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A，以及內含子14的g128659401 T>G，4個SNP位點中g128643840 G>A和g128643903 G>A 位點三穗鴨群體中基因型分布均顯著偏離哈代溫伯格平衡（Hardy-Weinberg平衡）（P<005）。4個SNPs均對蛋殼品質有顯著影響，其中g128643840 G>A、g128643903 G>A及g128659401 T>G位點能顯著提高蛋殼強度（P<005），g128643840 G>A位點顯著影響蛋黃色澤（P<005）。研究結果可作為蛋殼品質遺傳育種的參考。

關鍵詞：ITPR2基因;SNPs;三穗鴨;蛋殼品質;內含子

中圖分類號：S83489文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2020）02-0040-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.006The Relationship Between Genetic Variation of ITPR

2 Gene Intron and Duck Eggshell Quality of

Anas platyrhyncha domestica

TAN Guanghui ，LI Jiezhang ，WU Lei ，QIN Yuanyu，ZHANG Yiyu*

（Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，College of Animal Science，Guizhou University，West Campus，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：The Ca2+ regulatory gene ITPR

2 is an important ligand-gated gene in cells，and a key regulator of calcium ion transport activity across the membrane，which affects the quality of calcium eggshells An in-depth study on the correlation between ITPR2 polymorphism and eggshell quality was conducted in order to provide reference for the use of this gene to guide the genetic breeding of egg ducks In this paper，the ITPR2 gene polymorphism of A.platyrhyncha domestica was screened by routine PCR and direct sequencing The results showed that four SNP loci were found in ITPR2 gene，including g128643840 G > A，g128643903G > A and g128643906 G > A of intron 10，g128659401 T > G of intron 14，and the genotype distribution of g128643840G > A and g128643903 G > A of four SNP loci deviated significantly from Hardy-Weinberg equilibrium （P<005） Four SNPs had significant effects on the quality of eggshell Among them，g128643840 G > A，g128643903 G > A and g128659401 T > G loci significantly increased the strength of eggshell （P<005），and g128643840 G > A loci significantly affected the yellow color of eggshell （P<005） The results can be used as a reference for genetic breeding of eggshell quality

Keywords：ITPR2 gene; SNPs;

Anas platyrhyncha domestica; eggshell quality; introns

蛋殼可固定蛋形狀，保護蛋白、蛋黃以及維持內部環(huán)境的穩(wěn)定，同時能防止微生物從外界進入蛋殼內，還能滿足胚胎發(fā)育所需的部分營養(yǎng)物質。蛋殼質量通常影響蛋的孵化、運輸、保存以及蛋制品的深加工等，影響著禽蛋產業(yè)的發(fā)展和人類的健康，其破損率的增加會給禽蛋產業(yè)帶來巨大的經濟損失，因此，蛋殼質量在整個蛋品質中有著非常重要位置。眾多研究顯示，鈣是構成蛋殼的重要成分，并且決定蛋殼的脆性，在蛋殼總質量中鈣占絕大部分，

蛋殼形成時

其鈣沉積量直接由子宮部鈣結合蛋白（calcium binding protein，CaBP）的表達量來決定[13]。由此可見，蛋殼質量的好壞與Ca2+調控基因有著直接的聯(lián)系。

IP3Rs是對第一信使IP3（1，4，5-三磷酸肌醇）應答的一種普遍存在的細胞內鈣離子（Ca2+）釋放通道，在細胞內作為一種重要的配體門控參與胞質內Ca2+水平的精確調控;IP3與特異性受體IP3R結合后介導經由IP3R通道的胞內鈣釋放，在調節(jié)多種生物細胞功能活動如受精、細胞增殖、新陳代謝、分泌、平滑肌舒縮、神經信號傳遞和細胞凋亡等中發(fā)揮重要作用。ITPR2基因是IP3Rs的一種亞型，Ca2+是影響蛋殼品質的重要因素，以這方面來看ITPR2基因與蛋殼品質之間應該存在著相應的聯(lián)系[46]。此外，已有研究表明，ITPR2基因通過調控鈣離子來影響雞的蛋殼品質

[710]，因此從ITPR2基因的多態(tài)性、表達與蛋殼品質關聯(lián)性的角度進行深入的探究，具有一定的意義。本文以產蛋高峰期的三穗鴨為試驗材料，

探討蛋鴨ITPR2基因的多態(tài)性與蛋殼品質之間的關系，為今后利用該基因進行

三穗鴨育種提供參考，生產出品質更高的鴨蛋產品。

1材料與方法

1.1試驗材料

三穗鴨（Anas platyrhyncha domestica）60只，三穗鴨種蛋購于三穗縣，在三穗縣養(yǎng)殖合作社孵化后轉到貴州大學水禽養(yǎng)殖場同等飼養(yǎng)管理條件、健康無病、單體籠飼養(yǎng)，定期采集鴨蛋（編號與鴨翅號相同），用于蛋殼品質測定，提取每只鴨血樣采血1 mL，用于DNA提取。

1.2蛋殼品質的測量

參照文獻[11]描述方法進行蛋殼品質測量。

蛋重和蛋殼重：洗凈鴨蛋上鴨糞等污染物后用電子天平（型號為BL-320H，購自日本島津公司）稱量，得到蛋重單位為

g;去除蛋黃和里面的一些殘留蛋液稱量蛋殼重量，單位為g。

蛋形指數(shù)：用購自武漢道簡貿易有限公司的游標卡尺測量鴨蛋的長徑和短徑，精確到0.1 mm，長徑/短徑得到蛋形指數(shù)。

蛋殼厚度：北京天翔飛域儀器設備有限公司型號ETG-1061蛋殼厚度測定儀分別測定銳端、鈍端和側面的蛋殼厚度，取3個值得平均數(shù)得到蛋殼厚度，精確度0.01 mm。

蛋殼強度：蛋殼強度是蛋殼致密堅固性指標，指對蛋碰撞和擠壓的承受能力。用蛋殼強度測定儀（型號為EFR-01，購自北京天翔飛域儀器設備有限公司）測定，單位為N/cm2。

1.3血液基因DNA的提取、引物的設計

根據(jù)QlAamp DNA Mini Kit（50）DNA （北京擎科）提取試劑盒提取全部個體血樣DNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，核酸濃度檢測儀檢測DNA的OD值及濃度。參照NCBI數(shù)據(jù)庫中鴨

ITPR2基因DNA序列（登錄號：NC_040046.1），利用軟件primer 5.0對

ITPR2基因共設計3對多態(tài)引物ITPR2-F1/R1（F1：GAAGGTGGGAAGCTGTGTGT，R1：AGAGGCCACCAGCAGTAGAA，片段長520 bp）、ITPR2-F2/R2（F2：CAGGACTTCCCACCTGTTGT，R2：CTCCCTTTCTCCATGCTCTG，片段長523 bp）、ITPR2-F3/R3（F3：TCAATGCTGAGACTTGAAGACC，R3：GCTGTGATGGTGTCTTCTGC，片段長1121 bp）分別用于擴增鴨ITPR2基因g128643717～

g.128644237、g.128644900～g.128645423和g.128659269～g.128660388區(qū)域，3對引物退火溫度均為62℃，引物由上海

生物工程有限公司合成。

14PCR擴增程序

試驗選取2×Taq PCR Master Mix試劑進行目的基因的PCR擴增，擴增產物置于4℃冰箱中保存，PCR反應體系（20SymbolmA@L）和擴增程序如表1所示。采用15%的瓊脂糖凝膠，在120 V電壓、100 mA電流的條件下電泳30 min后檢測目的片段。檢測有目的條帶的產物送

上海

生物工程有限公司進行測序。測序結果采用DNAStar軟件和MegAlign程序進行初步篩選SNP位點。根據(jù)SNP位點，以個體DNA為模板，選用相應的引物進行PCR擴增，擴增產物送往上海生物工程有限公司進行測序分型。

15數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013對各多態(tài)位點的基因型以及蛋品質測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，運用SHEsis在線軟件（http：//analysisbio-xcn/）計算基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值（

SymbolcA@2）、連鎖不平衡的D 和SymbolgA@2值;PopGen32 V131軟件計算觀察雜合度（

He）、有效等位基因（Ne）、和多態(tài)信息量（PIC）;SPSS 180軟件中的一般線性模型對多態(tài)位點與蛋品質的關聯(lián)性進行分析，結果采用平均值±標準誤表示。

2結果與分析

21基因組DNA提取效果和引物特異性檢測

用15 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明（圖1），DNA條帶清晰、整齊、無雜帶，效果良好。用紫外分光光度計檢測DNA的OD260/OD280處于18～20之間，說明提取的DNA純度高，可用于下一步試驗;PCR擴增三穗鴨ITPR2多態(tài)引物結果見圖2，3對引物的PCR產物條帶大小與預設片段相同，條帶清晰明亮，可用于該基因多態(tài)性分析引物。

22三穗鴨ITPR2基因多態(tài)性檢測

利用Editseq和MegAlign程序對測序結果與GenBank中原始序列進行對比分析，結合測序峰圖（在Chromas轉件中打開）查找鴨ITPR2基因g128643717～ g128660388區(qū)域SNPs，發(fā)現(xiàn)在3對引物擴增的目的片段中發(fā)現(xiàn)4個SNP位點（圖3），分別是ITPR2內含子10的g128643840 G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A，以及內含子14的g128659401 T>G，4個SNPs均只產生兩種基因型，內含子屬于非編碼區(qū)域，不編碼蛋白，所以對氨基酸序列沒有影響。

23三穗鴨ITPR2基因多態(tài)位點遺傳特性分析

通過對

ITPR2基因的4個SNP位點進行遺傳特性分析顯示（表2）：g128643840

G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A 3個SNPs優(yōu)勢等位基因型均為雜合型GA，其優(yōu)勢頻率分別為0767、0617、0833，優(yōu)勢等位基因均為G，其頻率分別是0617、0692、0583，并且3個SNP位點均屬于中度多態(tài)（025<

PIC<05）;而g128659401 T>G位點優(yōu)勢等位基因型為純合子TT頻率為0750，優(yōu)勢等位基因T頻率0875，屬于低度多態(tài)（PIC<025）;4個SNP位點中g128643840 G>A和g128643903 G>A 位點三穗鴨群體中基因型分布均顯著偏離哈代溫伯格平衡（Hardy-Weinberg平衡）（

P<005），而g128643906 G>A和g128659401 T>G位點在三穗鴨群體中基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P>005）。

24三穗鴨ITPR

2基因SNPs與蛋品質關聯(lián)性分析

運用SPSS 180軟件中的一般線性模型分析三穗鴨ITPR2基因4個SNPs不同基因型對蛋品質的影響，結果顯示（表3）：g128643840 G>A和g128643903 G>A位點GA基因型以及g128659401 T>G位點基因型TT的蛋殼強度顯著大于其它基因型（P<005）;g128643903 G>A位點GA型與g128659401 T>G位點TT基因型的蛋殼厚度顯著高于其它基因型（P<005）;g128643840 G>A位點GG和GA基因型蛋黃色澤顯著高于其他基因型（P<005）。

3結論與討論

蛋殼品質是衡量蛋禽生產性能好壞的一個重要指標，影響蛋殼質量的因素有很多，如日糧中的鈣、磷、鋅、錳、維生素D

3等，其中鈣對蛋殼質量的影響尤為顯著[12]。蛋殼主要是在家禽的子宮部（蛋殼腺處）形成，其鈣化過程發(fā)生于非細胞結構的子宮液（含充足的Ca2+）中[13]。早關于蛋殼質量的影響因素的研究大多集中在飼養(yǎng)方式和飼喂水平等宏觀調控，隨著生產者和消費者關注度的提升，對蛋殼質量的研究逐漸從宏觀調控，轉向影響蛋殼形成的內源直接因素的調控，即分子遺傳育種的方法，通過基因表達調控蛋禽輸卵管和子宮內與蛋殼形成相關物質的表達量，將為改善蛋殼質量提供新的技術手段。FUJINO等[14]研究報道，ITPR

2基因可能對頜下腺內管細胞、腎小管細胞、附睪導管上皮細胞和卵巢濾泡顆粒細胞等的分泌功能具有調控作用。FUKUDA等[15]通過研究小鼠側鼻腺（LNG）腺泡細胞表明，

ITPR2和

IP3R3

基因介導鼻腔粘液分泌，影響鼻組織的維持以及氣味的感知。YUE等[16]研究表明，功能性ITPR

2在小鼠存儲區(qū)域網絡中表達，并可作為一種額外的鈣依賴機制來調節(jié)心臟起搏器活動以及其他與鈣相關的過程。

AKIMICHI等[17]提出，ITPR

2可能通過對肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的凋亡和鈣庫操縱性鈣內流（SOCE）的影響，在肺動脈高壓（PAH）的病理生理學中發(fā)揮抑制作用。目前關于ITPR

2基因的研究大多集中在人（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus），但其對鴨（Cairina moschata）蛋殼品質調效應影響尚未見相關報道。

在三穗鴨ITPR

2基因內含子檢測到4個SNP位點，均只產生兩種基因型，可能與試驗樣本數(shù)量較少有關或三穗鴨群體在多年的人工選擇或自然選擇過程中，導致另一種基因型消失;3個SNPs遺傳特性分析顯示，g128643840 G>A、g128643903 G>A和g128643906 G>A均屬于中度多態(tài)，表明試驗群體具有持續(xù)選育提高的可能性和必要性，可作為分子標記輔助選擇的潛在分子標記位點，對蛋鴨蛋殼品質改良提供了分子基礎。Hardy-Weinberg平衡檢驗發(fā)現(xiàn)g128643840 G>A和g128643903 G>A 位點偏離Hardy-Weinberg平衡，揭示這2個SNP位點可能受到突變、選擇、遺傳漂變等的影響，

或是受到長期的人工選擇的影響，但是更精確的遺傳多樣性評價可能需要結合更多的鴨樣本[18]。先前的研究證明，內含子雖然不會造成對應氨基酸的改變，但是它們可能會反復改變調控剪接的外顯子基序，如果這些突變位點與剪接位點相鄰可能導致剪接位點失活，而且單核苷酸的替換會改變mRNA的剪切效率或準確性，從而影響蛋白質的功能、構象和表達水平的變化[19]，因此內含子突變在遺傳育種中也是不可忽略的。關聯(lián)分析結果顯示，4個內含子SNPs不同基因型均對鴨蛋殼品質具有不同程度的影響，其中g128643840 G>A和g128643903 G>A及g128659401 T>G位點能顯著提高蛋殼強度，推測這3個SNPs可能是ITPR

2基因生物功能發(fā)揮的調控位點，其單核苷酸的改變可能影響了該基因對鈣離子釋放作用，進而調控蛋殼品質。而蛋殼強度是評價蛋殼之間最直接的體現(xiàn)，因此這2個SNPs對蛋殼品質的調控可能更加有效;另外g128643840 G>A位點顯著影響蛋黃色澤，前人研究表明，蛋黃色澤較好的蛋殼質量較高[20]，而且較好蛋黃色澤更能

得到消費者的喜歡，因此g128643840 G>A位點GG和GA基因型認為是有利基因型，但在實際生產中，蛋殼強度過高的蛋殼不一定都是有利的，過高蛋殼強度可能影響幼雛的孵化率，影響生產效益，所以需根據(jù)生產需求而選擇培育。

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