山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因克隆及表達模式研究

池永東，王 永，趙 越，朱江江，林亞秋

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與 利用教育部，四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

動物體內的脂肪組織分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織2種類型，白色的脂肪組織將多余的能量以甘油三酯的形式貯存在體內。棕色脂肪組織是一個產熱的器官，其主要通過在低溫寒冷時非顫抖產熱和消化吸收食物過程中消耗能量產熱2種方式調節能量代謝。脂肪細胞分化是一個復雜的過程，大量證據表明CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBPs)和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)2個轉錄因子家族是脂肪細胞基因表達和分化的重要調節因子[1]。CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)屬于堿性亮氨酸拉鏈類轉錄因子，家族成員C末端都有一個堿性亮氨酸拉鏈結構域[2]，能夠作為二聚體與特定DNA序列結合，從而調節下游的靶基因表達[3]。截至目前，已發現C/EBP家族的6個成員，即C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε和C/EBPζ[4]。C/EBP家族成員在細胞的增殖分化、能量代謝和信號轉導中發揮著重要作用，它們的C末端是亮氨酸拉鏈、中間DNA結合域、N末端為轉錄激活域[5]。其中C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ在小鼠的脂肪組織中均有表達，預示這3個基因參與脂肪的生成[6]。

C/EBPα是C/EBPs家族中最早從大鼠肝臟克隆出的家族成員，位于人的19號染色體上[7]，在包括前脂肪細胞、髓細胞、肝細胞、角質形成細胞和肺細胞等多細胞類型的有絲分裂和分化的調控中起著關鍵作用，并且在肝臟和脂肪中表達水平最高。通過選擇性識別并結合增強子核心序列，從而誘導細胞周期并影響參與細胞分化調控的轉錄因子。在3T3-L1前體脂肪細胞中過表達C/EBPα后將會使細胞周期滯留在G0/G1期[8]，另外C/EBPα過表達會導致3T3細胞轉化為巨噬細胞[9]。有研究結果顯示，過表達C/EBPα后B淋巴細胞會轉化為巨噬細胞，從而擁有吞噬功能[10-11]。轉錄因子C/EBPβ最初由Akira等[12]發現并命名，在多種細胞的增殖分化過程中發揮著重要的作用。He等[13]指出，在3T3-L1前體脂肪細胞向成熟細胞分化過程中C/EBPβ通過調節PPARγ和C/EBPα的啟動子上的核心序列，從而激活PPARγ和C/EBPα的轉錄，促進脂肪細胞分化。C/EBPδ可以調節幾種重要的脂肪形成基因，如脂聯素[14]、KLF15[15]以及C/EBPα[16]。在肝臟中過表達C/EBPδ后可以促進脂肪生成，并通過激活PPARG2的轉錄從而參與脂肪細胞的分化調控。

上述研究可以確定C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ參與動物脂肪細胞分化，但在山羊中尚未見報道。因此，本研究利用RT-PCR技術克隆山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因序列，并利用qPCR技術構建其組織和細胞時序表達譜，闡明3個基因在山羊組織和肌內前體脂肪細胞中的表達特征，并利用一系列生物信息學軟件分析其基因及蛋白序列，旨在為后續試驗揭示3個基因在山羊脂肪分化過程中發揮的作用機制提供參考，為培育優良的肉用山羊新品種開辟新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料采集 采集6只一周歲的簡州大耳羊公羊的心、肝、脾、肺、腎、大腸、瘤胃、背最長肌和皮下脂肪等組織，于液氮中速凍帶回實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 參照TRIzol的說明書提取各組織的總RNA通過NanoDrop 2000測定RNA的純度和濃度，參考Thermo反轉錄試劑盒合成cDNA置于-20 ℃儲存備用。

1.2.2 克隆引物設計 根據GenBank中登錄的牛C/EBPα(NM-176784)、C/EBPβ(NM-176788)和C/EBPδ(NM-174267)基因預測序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR擴增引物(表1)，送公司合成。

1.2.3 山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因的PCR擴增 以簡州大耳羊皮下脂肪組織cDNA為模板，進行PCR擴增，10 μL反應體系：模板1.0 μL， Master Mix 8 μL，上、下游引物各0.5 μL。反應條件：預變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 20 s，Tm 退火溫度見表1，60 s，延伸 72 ℃ 90 s，擴增35個循環；延伸72 ℃ 7 min PCR擴增產物通過天根DNA純化回收試劑盒回收后克隆至pMD-19T載體，送公司測序。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primers for PCR

1.2.4 序列分析 測序結果通過NCBI的Blast在線進行同源性比對；利用ProtParam分析推導蛋白質的理化性質；用MEGA 5.0軟件構建系統進化樹；通過TMHMM 2.0預測跨膜結構域；利用SignalP 4.1預測信號肽序列；采用Hopfield預測蛋白二級結構；通過SMART在線預測結構域；采用STRING交互式數據庫搜索可能相互作用蛋白。

1.2.5 山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因的組織表達分析 以前期西南民族大學現代生物技術國家民委重點實驗室篩選出的磷酸三丁酯基因(TBP)作為內參基因，根據克隆獲得山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因CDS區序列設計定量引物(表 1)。利用實時熒光定量PCR(qPCR)技術檢測3個目的基因在山羊組織中的表達模式，構建組織表達譜。20 μL qPCR反應體系：SYBR? Premix ExTaqTM (2×) PCR 10 μL，正反引物各1 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 7 μL。qPCR反應條件為95 ℃預變性15 s；95 ℃ 10 s，Tm 10 s，72 ℃ 15 s，38個循環。

1.2.6 山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因在肌內前體脂肪細胞中的時序表達分析 將本實驗室前期試驗收集誘導分化的0，1，2，3，4，5，6，7 d的山羊肌內前體脂肪細胞按照1.2.1方法提取RNA并進行反轉錄。選用泛素表達轉錄因子基因(UXT)和肽酰脯氨基順反異構酶B基因(PPIB)作為內參基因[17]，用qPCR技術檢測3個基因在山羊肌內前體脂肪細胞中的表達水平，qPCR反應條件同1.2.5。

2 結果與分析

2.1 山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因克隆

克隆獲得山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因序列信息及獲得GenBank登錄號見表2。

表2 克隆獲得山羊C/EBPs序列信息Tab.2 Sequence information of goat C/EBPs

2.2 山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因序列分析

2.2.1 蛋白質基本理化性質預測 山羊C/EBPα蛋白化學式為C1639H2558N484O489S9，等電點7.25。帶負電荷的氨基酸殘基和帶正電荷的氨基酸殘基各有36個，蛋白質整體不帶電。不穩定指數為64.18，平均親水系數為-0.627，屬于不穩定親水堿性蛋白。

C/EBPβ蛋白化學式為C1626H2531N457O487S11，等電點8.56。帶負電荷的氨基酸殘基和帶正電荷的氨基酸殘基分別為35，39個，蛋白質整體帶正電荷。不穩定指數為64.81，平均親水系數為-0.525，屬于不穩定親水堿性蛋白。

C/EBPδ蛋白化學式為C1187H1884N362O358S6，等電點為9.14。含有帶負電荷的氨基酸殘基和帶正電荷的氨基酸殘基分別有31，35個，C/EBPδ蛋白整體帶正電荷。不穩定指數為66.49，平均親水系數為-0.647，屬于不穩定親水堿性蛋白。

2.2.2 蛋白質結構預測 C/EBPα蛋白二級結構預測顯示，有63.17%的氨基酸形成無規則卷曲，29.75%的氨基酸形成α-螺旋，剩下7.08%的氨基酸形成延伸鏈(圖1-A)。該蛋白無信號肽和跨膜結構域。STRING交互式數據庫搜索結果顯示該蛋白可能和C/EBPβ、C/EBPδ、RB1、MYC、JUN、EP300、FOS、PPARG、CDK2和RUNX1發生相互作用(圖2-A)。

藍色豎線.α螺旋;紅色豎線.β折疊;紫色豎線.無規則卷曲。 α-helix, β-fold, random coil, are indicated, respectively, with the blue, the red, the purple.

C/EBPβ蛋白二級結構預測結果顯示，有58.97%的氨基酸殘基形成無規則卷曲，35.04%的氨基酸殘基形成α-螺旋，剩下5.98%的氨基酸殘基形成延伸鏈(圖1-B)。C/EBPβ蛋白無跨膜結構域，無信號肽結構。蛋白相互作用預測結果顯示，C/EBPβ蛋白可能和C/EBPα、C/EBPδ、KLF5、EP300和MYB等蛋白發生相互作用(圖2-B)。

C/EBPδ蛋白二級結構預測顯示，有53.52%的氨基酸形成無規則卷曲，42.58%的氨基酸形成α-螺旋，剩余3.91%的氨基酸可能形成延伸鏈(圖1-C)。該蛋白無信號肽結構，無跨膜結構域。該蛋白可能和C/EBPα、C/EBPβ、PPARG、SP1和MYC等蛋白存在相互作用(圖2-C)。

圖2 山羊C/EBPα (A)、C/EBPβ (B)和C/EBPδ (C)蛋白相互作用Fig.2 Prediction of proteins interacting with goat C/EBPα (A), C/EBPβ (B) and C/EBPδ (C) protein

2.2.3 氨基酸序列的同源性比對及構建進化樹 利用NCBI中的Blast在線比對分析顯示，山羊C/EBPα氨基酸序列與綿羊、牛和人的C/EBPα同源性分別為98%，100%，93%；山羊C/EBPβ氨基酸序列與綿羊、牛和人的氨基酸序列同源性分別為99%，96%和97%；山羊C/EBPδ氨基酸序列與綿羊、牛和人的同源性分別為100%，99%和88%。采用MEGA 5.0分別構建山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ氨基酸序列系統進化樹，結果如圖3所示，山羊C/EBPα與牛、白尾鹿和綿羊的親緣關系較近(圖3-A)；山羊C/EBPβ與羊駝、綿羊、人和牛的親緣關系較近(圖3-B)；山羊C/EBPδ與牛和豬具有較近的親緣關系(圖3-C)，3種氨基酸序列均與原雞的親緣關系較遠。

圖3 采用MEGA 5.0法構建山羊C/EBPα(A)、C/EBPβ(B)和C/EBPδ(C)氨基酸序列系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree was constructed based on C/EBPα (A)、C/EBPβ (B)和 C/EBPδ (C) amino acid sequence using MEGA 5.0

2.3 C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中的表達模式

qPCR結果顯示在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中C/EBPα和C/EBPδ表達模式相似，均在分化前表達水平最高，隨著分化時間的增加表達水平呈現下降趨勢；C/EBPβ在山羊肌內脂肪細胞中的表達隨著誘導分化天數的增加而呈上升趨勢(圖4)。

2.4 山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因組織表達分析

以皮下脂肪組織作為對照，分別對C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ3個基因的定量數據進行分析并繪制組織表達譜(圖5)。qPCR結果顯示3個基因的mRNA組織表達較為廣泛，其中C/EBPα基因在皮下脂肪中表達水平最高，其次在肝中也有較高水平的表達；C/EBPβ和C/EBPδ在山羊組織的表達模式相似，均在肺中表達水平最高。

A. C/EBPα mRNA在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量；B. C/EBPβ mRNA在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量；C. C/EBPδ mRNA在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量。不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

圖5 C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因 在山羊各組織中的相對表達Fig.5 Relative expression of C/EBPα, C/EBPβ and C/EBPδ gene in tissues of goat

3 討論

研究表明C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ在小鼠的脂肪細胞中存在表達，并在小鼠脂肪細胞分化過程中發揮重要作用[6]。C/EBPα可以誘導脂肪細胞中某些特異性基因表達，從而加速脂肪細胞成熟。在3T3-L1細胞中當C/EBPα被干擾后參與脂肪生成的基因不表達，并且脂肪細胞不分化[18]。在脂肪生成早期階段C/EBPβ在轉錄激活前直接結合到PPARγ啟動子誘導PPARγ表達[19]，C/EBPβ過表達后PPARγ表達量增加，肝臟中脂質積累增加[20]。作為前體脂肪細胞分化早期發揮作用的轉錄因子，C/EBPδ在3T3-L1前脂肪細胞中表達，可以誘導PPARγ和C/EBPα的表達，促進脂肪細胞分化[21]。在脂肪細胞分化早期過表達C/EBPδ后，C/EBPα和PPARγ的表達量也顯著增加，加快了脂肪細胞分化的過程[22]。為了最終闡明C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ在山羊脂肪細胞分化中的調控作用，本研究從獲得基因序列、明確生物學特征及闡明組織細胞表達特性入手來進行一系列研究。

首先利用RT-PCR成功克隆得到山羊C/EBPα1 062 bp、C/EBPβ1 056 bp及C/EBPδ873 bp，所編碼的蛋白無信號肽和跨膜結構域，均為不穩定親水堿性蛋白。通過NCBI在線比對發現，山羊C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ的氨基酸序列同其他哺乳動物的C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ序列具有較高的同源性，系統進化樹顯示三者氨基酸與牛的親緣關系比較近，與原雞的親緣關系較遠，說明了3種蛋白在生物進化過程中高度保守，符合進化規律。這可能與三者在哺乳動物進化及生命活動過程中發揮的作用有關。

本研究組織表達發現C/EBP家族3個成員在山羊不同組織中均存在廣泛表達，其中C/EBPα在皮下脂肪中表達水平最高，其次在肝臟中也有較高的表達水平；C/EBPβ和C/EBPδ具有相似的表達模式，均在肺中表達水平最高，其次在背最長肌中也存在較高水平的表達。推測3個基因可能參與調控山羊的生長發育。已有研究發現CCAAT/增強子結合蛋白主要表達在肝臟、脂肪和腸道組織中。C/EBPα在小鼠脂肪組織、肝臟、腸、肺、腎上腺和胎盤中以高水平表達[23-24]，C/EBPβ的組成型在肝臟、腸道、肺臟、脂肪組織、脾臟、腎臟和骨髓單核細胞中表達特別高[25-26]，而C/EBPδ的組成型主要表達在脂肪、肺和腸組織中[27]，王萬霞[21]在對鴨的研究中發現C/EBPα在腹脂和肺中表達水平最高，而C/EBPβ和C/EBPδ均在肺中表達最高。以上結果與本研究結果存在相似及不同之處，推測該家族基因表達可能具有物種特異性。

在山羊前體脂肪細胞分化過程中通過qPCR檢測發現C/EBPα和C/EBPδ表達模式相似，均在前體脂肪細胞中的表達水平最高且隨著分化時間的增加2個基因的mRNA表達水平逐漸下調，在分化6 d時表達水平趨于穩定，而C/EBPβ在山羊前體脂肪細胞分化前期表達水平較低，從3 d開始表達水平逐漸升高，在分化期間總體呈上升趨勢。推測在山羊前體脂肪細胞分化過程中C/EBPα和C/EBPδ在分化前期發揮作用，而C/EBPβ在分化后期發揮作用。Cao等[28]發現C/EBPα在3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化2 d檢測到表達，隨后表達逐漸升高，到達第6天表達量趨于穩定，C/EBPβ和C/EBPδ在分化的前2 d表達量達最大值，而當C/EBPα開始表達后C/EBPβ及C/EBPδ的表達水平開始下降。Rosen等[29]也報道在3T3-L1脂肪細胞開始分化后首先檢測到C/EBPβ和C/EBPδ表達，一段時間后才檢測到C/EBPα的表達。一致認為C/EBPβ在脂肪分化的前期發揮作用，并且指導有絲分裂的完成，而C/EBPα具有抗有絲分裂的作用，所以在脂肪分化的后期發揮作用[30]。這與本研究結果存在差異，推測可能是不同物種及檢測細胞時間點不同造成的這種差異。同時本研究發現3個C/EBP家族成員在脂肪細胞分化過程中表現出表達先后順序的現象，也反映出三者在調控脂肪細胞分化過程中可能存在相互作用和級聯調控的關系，在對三者蛋白進行互作分析時也發現三者確實存在交互作用。

本研究成功克隆得到山羊C/EBPα1 062 bp、C/EBPβ1 056 bp及C/EBPδ873 bp，三者所編碼的蛋白均為不穩定親水堿性蛋白，均無跨膜結構域和信號肽。C/EBPα在皮下脂肪組織中高水平表達，而C/EBPβ和C/EBPδ均在肺中高表達。在肌內前體脂肪細胞分化過程中，C/EBPα和C/EBPδ表達模式相似，均在分化0 d表達水平最高且隨著分化時間的增加二者表達水平逐漸下調，在分化6 d時逐漸平穩表達，在山羊前體脂肪細胞分化前期C/EBPβ表達水平較低，從3 d開始表達水平逐漸升高，在分化期間總體呈上升趨勢。研究結果表明，在山羊脂肪細胞分化過程中C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ3個基因發揮著重要作用。