HPLC法測(cè)定枸櫞酸莫沙必利分散片的有關(guān)物質(zhì)

孫亞敏，欒會(huì)妮，徐勤娟，李錫勇

(威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264300；)

枸櫞酸莫沙必利(Mosapride Citrate)為大日本制藥株式會(huì)社開(kāi)發(fā)的胃動(dòng)力藥，是一強(qiáng)效選擇性5-羥色胺(5-HT4)受體激動(dòng)劑，通過(guò)興奮肌間神經(jīng)叢的5-HT4受體，刺激乙酰膽堿釋放，從而增強(qiáng)胃腸運(yùn)動(dòng)，但不影響胃酸分泌，是一安全有效的胃動(dòng)力藥[1-2]。臨床用于慢性胃炎、功能性消化不良、反流性食管炎及手術(shù)伴隨的一系列胃腸道癥狀的緩解[3]。本實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]和JP16版Mosapride Citrate Powder質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，采用梯度洗脫，建立了檢測(cè)枸櫞酸莫沙必利分散片有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法，為枸櫞酸莫沙必利分散片的質(zhì)量研究提供了有效的分析手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀(配有四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、2998 PDA檢測(cè)器、2489UV檢測(cè)器、Empower工作站)；Mettler Toledo XS205電子天平；Mettler Toledo SevenEasy pH計(jì)；SK8200LH數(shù)控超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

枸櫞酸莫沙必利對(duì)照品(批號(hào)：100656-200501，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，雜質(zhì)A(批號(hào)：7-DPM-9-2，TRC)，雜質(zhì)B(批號(hào)：13-SWZ-97-2，TRC)，雜質(zhì)C(批號(hào)：4-DPM-73-4，TRC)，枸櫞酸莫沙必利原料(批號(hào)：130301，國(guó)內(nèi)某公司自制)，枸櫞酸莫沙必利分散片(批號(hào)：130801、130802、130803，自制)。所用試劑除乙腈為色譜純之外，其它均為分析純。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

色譜柱為Welch SX-C18(4.6×150mm，5μm)；以0.05mol/L的枸櫞酸溶液(用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0)為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，按下表梯度程序進(jìn)行洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm；柱溫為40℃；進(jìn)樣體積為10μl；稀釋液為乙腈-水(40∶60)。

表1 色譜條件

2.2 溶液的配制

取枸櫞酸莫沙必利分散片細(xì)粉適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利25mg)，置25mL量瓶中，加稀釋液超聲使枸櫞酸莫沙必利溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用稀釋液定量稀釋200倍，搖勻，作為對(duì)照溶液(0.5%)。

2.3 空白輔料

取空白輔料適量(約相當(dāng)于含枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，依法測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由結(jié)果可知，空白輔料對(duì)本品有關(guān)物質(zhì)檢查無(wú)干擾。

2.4 峰定位

精密稱取枸櫞酸莫沙必利原料、雜質(zhì)A、B、C對(duì)照品各約5mg，置50mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取0.5mL，置20mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為峰定位溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，莫沙必利與相鄰雜質(zhì)及雜質(zhì)之間的分離度均達(dá)到要求。莫沙必利及雜質(zhì)A、B、C的保留時(shí)間(RT)和相對(duì)保留時(shí)間(RRT)等見(jiàn)表2。

表2 峰定位與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Test results of Peak location and system applicabilit

2.5 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

按如下方法分別對(duì)枸櫞酸莫沙必利分散片和空白輔料進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)。

2.5.1 酸破壞

取樣品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液5mL溶解，再加1mol/L-1鹽酸溶液5mL，95℃水浴加熱30min，冷卻，用1mol/L的NaOH溶液5mL中和，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。

2.5.2 堿破壞

取樣品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液5mL溶解，再加1mol/L NaOH溶液5mL，95℃水浴加熱30min，冷卻，用1mol/L鹽酸溶液5mL中和，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。

2.5.3 氧化破壞

取樣品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液5mL溶解，再加3%H2O2溶液5mL，95℃水浴加熱10min，冷卻，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。

2.5.4 高溫破壞

取樣品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，置105℃烘箱中加熱12h，用稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。

2.5.5 光破壞

取在4500Lx光照箱中放置5天樣品適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。

精密量取上述破壞溶液，分別依法測(cè)定，記錄色譜圖(圖3-圖7)，考察主成分峰純度、與降解雜質(zhì)分離度和降解雜質(zhì)峰歸屬(RRT)、最大吸收波長(zhǎng)以及物料守恒。結(jié)果表明，各強(qiáng)制降解條件下，主峰峰純度、與相鄰雜質(zhì)的分離度均符合要求；本品對(duì)堿、光均不敏感，氧化破壞產(chǎn)生雜質(zhì)C(莫沙必利N-氧化物)；而熱破壞主要產(chǎn)生雜質(zhì)B(莫沙必利檸檬酰胺)、雜質(zhì)C；主成分及各降解雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)均在274nm波長(zhǎng)左右；通過(guò)計(jì)算，各破壞條件下稱樣量/總峰面積與未破壞時(shí)稱樣量/總峰面積的比值基本一致，且物料守恒。說(shuō)明本方法能有效的檢出各降解雜質(zhì)，專屬性強(qiáng)。

圖1 空白輔料Fig. 1 blank excipient

圖2 峰定位Fig. 2 Peak location

圖3 酸降解Fig. 3 Acid degradation

圖4 堿降解Fig. 4 Alkali degradation

圖5 氧化降解Fig. 5 Oxidative degradation

圖6 高溫降解Fig. 6 High temperature degradation

圖7 光照降解Fig. 7 Photodegradation

2.6 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

由雜質(zhì)A、B、C以及強(qiáng)制降解試驗(yàn)中各降解雜質(zhì)的光譜圖可知，在274nm波長(zhǎng)處均有較大吸收，而莫沙必利的最大波長(zhǎng)為274nm，故選擇274nm作為本品有關(guān)物質(zhì)檢查的檢測(cè)波長(zhǎng)[6]。

2.7 已知雜質(zhì)研究

2.7.1 線性關(guān)系與范圍

取枸櫞酸莫沙必利、雜質(zhì)A、B、C對(duì)照品各10.0mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分別置20mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻；精密量取各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度C(μg/mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 枸櫞酸莫沙必利與各雜質(zhì)的線性關(guān)系及檢測(cè)限與定量限結(jié)果Tab.3 Linear relationship , detection limit and quantitative limit results of mosapride citrate and impurities

2.7.2 定量限

以信噪比(S/N)為10∶1的濃度為最低定量限溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，莫沙必利和雜質(zhì)A、B1、B2、C的保留時(shí)間的RSD分別為0.07%、0.13%、0.17%、0.20%、0.10%；莫沙必利和雜質(zhì)A、B、C的峰面積的RSD分別為1.76%、2.09%、2.41%、2.48%。

2.7.3 檢測(cè)限

以信噪比(S/N)為3∶1的濃度為最低檢測(cè)限溶液，進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7.4 校正因子

采用線性與范圍試驗(yàn)項(xiàng)下枸櫞酸莫沙必利標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與各雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比計(jì)算各雜質(zhì)相對(duì)枸櫞酸莫沙必利的校正因子，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的校正因子均在0.9～1.1范圍之外，須用主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量；而雜質(zhì)C可直接用主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。

表4 已知雜質(zhì)校正因子試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Test results of known impurity correction factors

2.7.5 精密度

精密量取“2.7.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL，置20mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為100%(5μg/mL-1)濃度溶液。同法配制80%(4μg/mL-1)和120%(6μg/mL-1)濃度溶液，每個(gè)濃度配制3份。精密量取上述三種溶液各10μl，，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。結(jié)果表明，在80%(4μg/mL-1)、100%(5μg/mL-1)和120%(6μg/mL-1)三個(gè)濃度范圍內(nèi)，莫沙必利峰面積的RSD分別為0.89%、0.70%、0.80%，雜質(zhì)A峰面積的RSD分別為0.77%、0.33%、0.88%，雜質(zhì)B峰面積的RSD分別為0.84%、0.70%、0.98%，雜質(zhì)C峰面積的RSD分別為0.72%、0.39%、0.74%。說(shuō)明本方法重復(fù)性較好。

2.7.6 中間精密度

取本品樣品(批號(hào)：130801)和雜質(zhì)對(duì)照品溶液，由不同試驗(yàn)員在不同的時(shí)間用不同儀器，分別依法測(cè)定6份，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算已知雜質(zhì)的含量，計(jì)算RSD，考察本方法的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，雜質(zhì)A、B、C含量的RSD分別為6.79%、3.15%和5.82%。說(shuō)明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7.7 回收率

取本品適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加入“2.7.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL，用稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為100%濃度的供試品溶液，同法配制80%濃度的供試品溶液和120%濃度的供試品溶液，每個(gè)濃度配制3份；另取“2.7.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL，置20mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為對(duì)照品溶液；另取本品適量(約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，用稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為空白校正溶液。精密量取供試品溶液、對(duì)照品溶液和空白校正溶液各10l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，用空白校正溶液校正后，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各雜質(zhì)的含量，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，雜質(zhì)A、B、C的平均回收率分別為98.53%、99.01%和101.28%，RSD分別為1.14%、0.98%和1.65%。表明本法的回收率良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性

精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，室溫放置，分別于配制后0、2、4、6、8h取樣測(cè)定，通過(guò)對(duì)照品峰面積和有關(guān)物質(zhì)(按面積歸一化法計(jì)算)的變化情況的變化情況，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液中莫沙必利和雜質(zhì)A、B、C峰面積的RSD分別為 0.51%、0.63%、0.60%和0.55%；供試品溶液中雜質(zhì)A、B、C、其他雜質(zhì)之和及總雜的含量分別為0.01%、0.07%、0.07%、0.18%和0.33%，基本上沒(méi)有變化。說(shuō)明對(duì)照品溶液及供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性

在本方法色譜條件的基礎(chǔ)上，分別改變流速(0.8mL · mi-n和1.2mL · mi-n)、柱溫(35℃和45℃)、檢測(cè)波長(zhǎng)(269和279nm)、流動(dòng)相pH值(3.8和4.2)和色譜柱(Agilent XDB-C18)，取供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液，每個(gè)條件進(jìn)樣3次，考察本實(shí)驗(yàn)的耐用性。結(jié)果表明，莫沙必利和雜質(zhì)A、B、C的保留時(shí)間、柱效、對(duì)稱性和分離度均符合要求，且雜質(zhì)A、B、C和其他單雜、總雜均無(wú)顯著性差異(RSD≤10)。

2.10 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

表5 有關(guān)物質(zhì)檢查外標(biāo)法與自身對(duì)照法比較結(jié)果Tab.5 Comparison of the results of external standard method and self-control method for related substance examinatio

取本品三批樣品(批號(hào)：130801、130802、130803)，分別采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法(A法)和外標(biāo)法(B法)計(jì)算樣品中已知雜質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，加校正因子的主成分自身對(duì)照法和外標(biāo)法測(cè)定已知雜質(zhì)結(jié)果基本一致，且均符合規(guī)定。為方便檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法檢查本品的有關(guān)物質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1 相對(duì)保留時(shí)間(RRT)

本方法采用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)已知雜質(zhì)進(jìn)行定位，通過(guò)線性與范圍試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)中各已知雜質(zhì)保留時(shí)間與莫沙必利保留時(shí)間的比值，確定了雜質(zhì)A、B、C的相對(duì)保留時(shí)間[7,8]；同時(shí)，本方法指定了Welch SX-C8色譜柱為本品有關(guān)物質(zhì)檢查專用色譜柱。

3.2 校正因子

根據(jù)《藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則》，雜質(zhì)的校正因子在“0.9～1.1”之內(nèi)的，可直接采用主成分的自身對(duì)照法對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行定量；超出此范圍，而在“0.2～5.0”之內(nèi)的，可采用加校正因子的主成分的自身對(duì)照法對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行定量。故雜質(zhì)A和B采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算含量，而雜質(zhì)C可直接采用主成分自身對(duì)照法進(jìn)行定量。

3.3 雜質(zhì)B

雜質(zhì)B是一對(duì)映異構(gòu)體(B1和B2)，在色譜行為上表現(xiàn)為兩個(gè)峰。定位時(shí)，分別對(duì)這這兩個(gè)峰進(jìn)行了定位；定量時(shí)，則將B1和B2合并為一個(gè)峰(雜質(zhì)B)以峰面積之和進(jìn)行定量。

3.4 耐用性

本品對(duì)波長(zhǎng)、柱溫、色譜柱的耐用性較好。流速為1.2mL/min時(shí)，莫沙必利N-氧化物與相鄰的雜質(zhì)峰合并成一個(gè)雜質(zhì)峰，使雜質(zhì)總數(shù)減少，但總雜沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明增大流速，不利于莫沙必利N-氧化物與相鄰雜質(zhì)峰的分離。流動(dòng)相pH降低時(shí)，主峰保留時(shí)間減小，不利于主峰與相鄰雜質(zhì)的分離。