環狀RNA最新研究進展

李鐵軍，于勇，張孝衛，杜雪，史世娟，黃華

作者單位：250013 山東，濟南市衛生科技交流服務中心

環狀 RNA（circRNA）是一大類共價閉合環狀 RNA，作為競爭性內源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）中的一員，參與 circRNA-miRNA-mRNA 網絡調控，在生命活動和有關疾病的調控中發揮著重要作用。circRNA 通過外顯子、內含子或兩者的反剪接而產生，形成外顯子或內含子 circRNA。研究表明circRNA 是普遍存在的分子，超過了人類細胞中分布的相關線性 mRNA；circRNA 由于具有共價閉環結構，對 RNase R 具有抗性，比線性 mRNA 具有更穩定的特性；circRNA 在不同物種中高度保守；circRNA 常表現為組織/發育階段特異性表達[1]。有關 circRNA 的生物發生模式、機制、分類、生物學特點等已有眾多綜述予以總結歸納，在此不再詳述。

近兩年，circRNA 的生物學作用方面的研究增長迅速，其中關于 miRNA 海綿作用、翻譯作用的研究占了大多數。海綿作用是 circRNA 的主要作用之一，此外，最近新發現融合環狀 RNA（f-circRNA）在腫瘤的發生發展中起到了重要作用，引發人們關注。本文對此進行了歸納整理。

1 circRNA 的 miRNA 海綿作用

一般認為，circRNA 的重要功能之一是通過其結合位點負調控相應的 miRNA，從而影響其下游靶點分子，即所謂海綿作用。其中最具代表性的是人類 circRNA 小腦退化相關蛋白 1 轉錄本 (CDR1as)/ciRS-7，作為 miR-7 海綿，包含 70 多個 miR-7 結合位點，與 miR-7 結合并調控其功能，該研究首次證明 circRNA 具有 miRNA 海綿的功能。但直到 2017年，也僅有數種 circRNA 的海綿作用得到驗證。隨著轉錄組測序技術（RNA-seq）的發展，大量 circRNA 被發現，circbank 已收錄超過 14 萬種 circRNA，為 circRNA 的研究提供了有力支持。circRNA 海綿作用的研究方法成熟易行，近兩年來，有關 circRNA 海綿作用的研究急劇增長，主要集中在癌癥方面，為癌癥治療提供了一種新的治療思路，并使得 circRNA 成為有希望的潛在生物標志物。從目前的研究看，circRNA 在癌癥中的海綿作用大致可分為抑癌和促癌兩大類。近期 circRNA 海綿作用的研究如表 1 所示（circRNA 名稱從原文）。

表1 circRNA 海綿作用一覽表

續表 1

表中統計了 62 種 circRNA 海綿，起促癌作用的 41 種，抑癌作用的 14 種，抑制 HCV 增殖 1 種，其他作用 6 種。涉及白血病、肝癌、胃癌、骨肉瘤、膠質瘤、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌、肺腺癌、口腔癌、喉鱗癌、宮頸癌、胰腺導管腺癌、非小細胞肺癌等 15 種癌癥。同種腫瘤可以與數種 circRNA 相關。

其中抑癌作用的 14 種 circRNA，除 3 種人工合成的外，其余 11 種均在相應細胞系或組織中表達下調。通過上調這些 circRNA，可以有效抑制癌細胞的生長、遷移和侵襲。而 41 種促癌 circRNA，與非癌組織相比表達上調，其過表達與臨床嚴重程度密切相關，促進癌細胞的遷移和 侵襲。

一般認為 circRNA 海綿與對應的 miRNA 呈負相關，并由此上調下游靶點來發揮作用。但也有研究認為 circRNA 海綿可以與對應的 miRNA 呈正相關。Li 等[30]在骨肉瘤的研究中發現，Circ_ORC2 具有miR-19a 的結合位點，其表達與 miR-19a 表達呈正相關。circ_ORC2 與 miR-19a 結合，增強了 miR-19a 的表達，從而抑制下游 PTEN 的表達，激活 Akt 通路，促進骨肉瘤細胞的生長和侵襲。這些發現豐富了circRNA 的分子調控機制。Du 等[16]的研究也認為 Circ_ANKIB1 促進 miR-19b 的表達，抑制下游靶基因SOCS3 的表達，進而激活 STAT3 通路，circRNAs 穩定了 miRNA 的功能，對這一新功能的進一步研究將為腫瘤等疾病的診斷和治療提供有意義的參考。

具有海綿作用的 circRNA 一般來自生物體自身，但也不排除來自外界的感染入侵。Qiao 等[15]首次報道 EB 病毒（EBV）編碼的環狀 RNA 可以通過海綿化 miRNAs 促進其靶基因的上調表達，涉及與 EBV 相關的惡性腫瘤。EBV 環狀 RNA 共海綿化了 56 個 miRNA。其中 5 個 miRNA 與其靶標之間的網絡包括 1414 個基因、1419 個節點和 2423 條邊。這些靶點在多種類型中富集，大多數在 EBV 感染細胞中被上調。

值得注意的是，含有 miRNA 結合位點的 circRNA，是否一定是通過抑制對應的 miRNA 而發揮作用呢？Garikipati 等[62]研究認為，circFndc3b 在心肌梗死后心臟中的過度表達，增加了血管內皮生長因子（VEGF）的表達，通過 FUS/VEGF-A 軸調節心肌梗死后的心臟修復，增強新生血管，改善左心室功能，是促進心肌梗死后心功能和重構的潛在策略機制。該研究認為盡管通過熒光素酶報告基因實驗，circFndc3b 可能確實與 miR-298-5p、miR-412-3p 和 miR-93-3pm 結合，但 circFndc3b 在內皮細胞和成心肌細胞中都不作為 miRNA 海綿來發揮作用。而且這些 miRNA 的水平在心肌梗死后的心臟中經常升高而不是降低。

我們可以看出，同一癌癥可以由不同 circRNA 通過不同的途徑影響其發生發展，海綿作用是各種癌癥發生發展的重要機制之一。circRNA 發揮其海綿作用的機制，一方面是通過抑制或減少 miRNA 發揮作用，另一方面與 miRNA 結合后，可能通過某種反饋機制刺激，反而增加了相應 miRNA 的表達。海綿作用可能是部分 circRNA 的主要功能，但即使含有 miRNA 結合位點，也不一定通過其發揮作用。

此外，人工合成 circRNA 海綿治療癌癥或其他疾病的研究也開始了有益探索。Liu 等[4]使用 T4 RNA 連接酶 1，對線性 RNA 進行 5'-3' 端連接實現環化，人工合成含有 miR-21 結合位點的 circRNA。這些人工合成的 circRNA 抑制 miR-21 對下游蛋白靶點的活性，包括腫瘤蛋白 DAXX，抑制癌細胞的增殖。Wang 等[57]設計并構建了一個包含 miR-21 和 miR-93 結合位點的 circRNA，抑制了內源性 miR-21 和miR-93，促進了食管癌細胞凋亡，顯著抑 制細胞的增殖和遷移。Jost 等[5]設計的人工體外轉錄和連接的 circRNA 海綿，可以從 HCV 中分離 miRNA-122，還可以作為蛋白海綿，與隔離丙型肝炎病毒繁殖所需宿主因子的序列，甚至病毒蛋白本身結合，從而抑制 HCV 增殖。盡管如此，無論是在體外合成的 circRNA，還是潛在的基于質粒的表達構建物，在體內生成人工 circRNA，都需要通過適當的傳遞平臺進入細胞。如脂質納米顆粒（LNPs）和合成納米顆粒目前仍是克服 RNA 治療細胞屏障的最佳 選擇。

除了與癌癥相關疾病外，Hall 等[3]研究認為 circ_Lrp6 是細胞內的調節劑和 miR-145 的天然海綿，阻礙了 miR-145 介導的 VSMC 遷移、增殖和分化的調控，可能在血管發病機制中發揮作用。

2 circRNA 的翻譯作用

有報道稱，一些含有內核糖體進入位點元件（IRES）或原核核糖體結合位點的環狀 RNA 可以編碼不同于其典型對應物的蛋白質[1]。Yang 等[63]首次報道了 RNA 最豐富的堿基修飾 n6-甲基腺苷（m6A）促進了circRNA 在人類細胞中蛋白翻譯的高效起始。此外，m6A 驅動的 circRNA 翻譯被發現是廣泛的，數百種內源性 circRNA 具有翻譯潛力，提示 circRNA 衍生蛋白在細胞對環境應激反應中發揮作用。

Xia 等[64]發現了一種新 AKT 轉錄本變體 Circ-AKT3。Circ-AKT3 利用重疊的啟止密碼子編碼了一種 174 個氨基酸（aa）的新蛋白 AKT3-174aa。與配對的鄰近正常腦組織相比，Circ-AKT3 在膠質母細胞瘤（GBM）組織中表達水平較低。AKT3-174aa 過表達降低了 GBM 細胞的增殖、耐輻射能力和體內致瘤性，而 circ-AKT3 的下調則增強了星形細胞瘤細胞的惡性表型。AKT3-174aa 競爭性地與磷酸化的 PDK1 相互作用，減少 AKT-thr308 磷酸化，并在調節 PI3K/Akt 信號強度中起負調控作用。

3 融合環狀 RNA

2016年，Guarnerio 等[65]發現了融合環狀 RNA（fusion circRNAs，f-circRNA）的存在。我們知道，在一些疾病中，非同源染色體可發生部分重排，從而將兩個原本分離的基因連接在一起，形成“融合基因”，并表達融合蛋白。在研究了 PML/RARα、MLL/AF9 等多個白血病染色體易位的情況后發現，融合基因在轉錄后剪接生成線性融合 mRNA 時，在易位的斷點區域上、下游內含子中含有互補序列（如 alu 序列）時，可以通過反剪接形成一個或多個不同的跨越斷點區域的新環狀 RNA，即所謂 f-circRNA。而且這些 f-circRNA 是促進細胞轉化的原癌性 RNA，可觸發細胞增殖速度的增加并形成病灶，在體內對白血病進展起促進作用，并增加了白血病的耐藥性。但 f-circM9 本身可能不足 以引發腫瘤發生，可能需要額外的致癌因素。此外，在 SK-NEP-1 肉瘤細胞株和 H3122 肺癌細胞株中也發現有 f-circRNA。此后，f-circRNA 開始引起人們的關注。

2018年，Babin 等[66]使用 CRISPR/Cas9 技術來誘導特定的染色體易位，證明新形成的易位可以直接表達轉錄自 NPM1-ALK 斷點的特定 f-circRNA。在 ALCL 患者的腫瘤細胞系中發現的 f-circRNA 也在不同的易位模型中被發現。這些結果表明使用 CRISPR/Cas9 誘導原位易位，可以獲得相關的癌癥模型，包括新生 f-circRNA 的表達。

最近，Tan 等[67-68]在非小細胞肺癌（NSCLC）融合基因 EML4-ALK 變體 3b(v3b) 中發現了兩種融合環狀 RNA：F-circEA-4a 和 F-circEA-2a。F-circEA-4a 可在 eml4-alk 陽性的 NSCLC 患者血漿中檢測到，可作為潛在的液體活檢生物標志物。而 F-circEA-2a 雖然對細胞增殖影響不大，但促進了非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲，表明環狀 RNA 在 eml4-alk 陽性非小細胞肺癌中的重要作用。Wu 等[69]也證實 NSCLC 融合基因 SLC34A2-ROS1 產生的融合環狀 RNA F-circSRs 能夠促進肺癌細胞遷移。

從有限的研究中可以看到，f-circRNA 協同融合蛋白，在一些腫瘤的發展進程中起促進作用。f-circRNA 是否具有普通 circRNA 的海綿吸附、翻譯等作用，或者具備普通 circRNA 不具備的特殊作用還有待進一步探究。

4 總結

眾多研究表明，circRNA 具有 miRNA 海綿作用，與腫瘤等疾病的發展密切相關。circRNA 海綿作用的研究中，相當一部分是基于微陣列芯片篩查的結果，找出表達升高或降低的 circRNA，然后探究這些 circRNA 對腫瘤細胞的作用。遺憾的是對同種腫瘤，不同團隊使用不同芯片得出的結果可能完全不同，盡管這并不意味著結果的不準確。且上述研究中，促癌作用全部是表達升高的 circRNA，抑癌作用全部是表達降低的 circRNA。雖然現有研究還未支持這種情況，但是否應該存在這種可能：雖然表達升高，但起抑癌作用。而且一種腫瘤可以對應數種 circRNA，它們之間是什么關系，如果同時使用幾種 circRNA 處理腫瘤，是否可以收到更好的效果？circRNA 因為閉合環狀這一結構特點而被分為一大類，但其來源、產生方式、功能、體內分布等可能完全不同，是不是應該有更科學細致的分類，是否具有不同作用的 circRNA 應該自成一類？這些都是 circRNA 研究中需要思考和解決的問題。