竹葉石膏湯改善2型糖尿病大鼠記憶功能衰退癥狀的作用機制

李玉潔 李雪瑩 陳瑩瑩 李藝璇 安敬文 王聰慧 張肖雅 楊麗萍

(河南中醫藥大學 1基礎醫學院，河南 鄭州 450046；2第一臨床醫學院)

2017年國際糖尿病聯盟(IDF)發布的《糖尿病地圖》中顯示，全球約有4.25億糖尿病患者，推測到2045年，全球糖尿病患病人數將達到6.29億，中國患病人數將達1.343億〔1〕。糖尿病屬于慢性疾病，是由于胰島素分泌或作用缺陷所引起的代謝性疾病〔2〕，而絕大多數糖尿病患者罹患的是2型糖尿病(T2DM)〔3〕。流行病學研究報告指出，T2DM是發生認知功能障礙和癡呆的獨立危險因素，且該病導致患者日后發生癡呆的概率約為正常人的1.6倍〔4〕。研究指出，糖尿病患者并發認知功能減退(CI)的發生率為10.8%～17.5%，輕度認知功能障礙(MCI)是阿爾茨海默病(AD)的早期階段，每年有10%～15% 會演變為AD〔5〕。藥物干預是治療糖尿病及其并發癥的有效途徑，但目前已有的降糖藥對于T2DM引起的記憶力下降尚沒有較好的治療作用，因此探索T2DM發生認知功能障礙的作用機制，尋找有效的治療藥物，對糖尿病及其并發癥的預防和治療有重大意義。傳統中醫認為，糖尿病屬于中醫學消渴范疇，基本病機為陰津虧耗，燥熱偏盛〔6〕。本證治法若只取清熱而不益氣生津，則氣液難復；若只益氣生津而不清熱，又慮邪熱復熾，余熱復燃。正如葉天士所說“爐煙已息，灰中有火”。竹葉石膏湯首見于《傷寒論》，由竹葉、石膏、麥冬、人參、半夏、粳米、炙甘草組成，此湯清熱養陰，益氣生津，為療效優越的清補之劑，既在于清，又在于補，扶正祛邪，重在調和，被稱為“以大寒之劑，易為清補之方”，主要用于治療消渴癥。現代藥理學研究發現，方中人參的主成分人參皂苷Rg1具有較強的神經保護作用〔7〕；竹葉中竹葉黃酮可以提高大鼠海馬神經元的存活率〔8〕；半夏中的鳥苷依賴G蛋白耦聯受體(GPCR)介導的細胞內信號轉導通路能發揮神經保護作用〔9〕等。但目前，關于竹葉石膏湯改善T2DM記憶力下降的相關研究幾乎沒有，因此本實驗觀察竹葉石膏湯對T2DM大鼠學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)北京索萊寶生物科技有限公司產品，批號：18883-66-4；安穩型血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司產品，批號2804NR；豬油，浙江金恩食品有限公司產品，批號20180809；蛋黃粉，河南宏益生物科技有限公司產品，批號20180628；豬膽鹽，北京奧博星生物技術有限責任公司產品，批號20180605；膽固醇，北京索萊寶生物科技有限公司產品，批號108D113，50%葡萄糖溶液，開封制藥集團有限公司產品，批號：H41022336；大鼠β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，東莞市譜標實驗器材科技有限公司產品，產品貨號：DRE20040；大鼠胰島素ELISA試劑盒，東莞市譜標實驗器材科技有限公司產品，貨號：DRE20732；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒，東莞市譜標實驗器材科技有限公司產品，產品貨號：DRE20040，蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所產品，貨號：A045-2。

1.2中藥制備 竹葉石膏湯中藥免煎劑均購自廣東一方制藥有限公司，用藥量按千克體重折算系數法計算大鼠等效劑量，使用時將粳米熬湯，過濾，用米湯溶解藥物。

1.3儀器 MultisKanFc酶標儀(Thermo Fisher Scientific，美國)；KDC-160HR低溫高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司)；AB204-N萬分之一精密分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。Morris水迷宮(成都太盟軟件有限公司)

1.4動物 8周齡，SPF級雄性SD大鼠10只，體重(320±20)g，72周齡，SPF級雄性SD大鼠50只，體重(530±30)g，均購自山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(晉)20150001，實驗室保持12 h光照，12 h避光循環飼養，按照組別分別給予標準飼料和高糖高脂飼料，自由飲水。實驗室溫度20～25℃，濕度50%～60%。

1.5分組及建模

1.5.1T2DM大鼠模型的誘導 取8周齡青年雄性大鼠10只，設為正常組，給予正常飼料喂養，另取72周齡老年雄性大鼠50只采用高糖高脂飲食結合小劑量鏈脲佐菌素(STZ，45 mg/kg)誘導T2DM大鼠模型〔6〕，具體方法為，所有造模大鼠給予高糖高脂飼料喂養1 w后，禁食不禁水24 h，之后大鼠腹腔注射STZ 45 mg/kg，3 d后檢測空腹血糖，空腹血糖值≥16.7 mmol/L，視為建模成功〔10〕。高脂飼料配方，參照AIN-93G嚙齒類實驗動物合成飼料配方〔11〕配制方法如下：豬油40 g，膽固醇40 g，膽鹽20 g，蛋黃粉40 g，普通飼料600 g，蒸餾水適量。充分攪拌后晾干，制成長為0.8 cm的條狀飼料。

1.5.2動物的分組給藥 將造模成功的大鼠隨機分為模型組,竹葉石膏湯低劑量(低劑量)組、竹葉石膏湯高劑量(高劑量)組，每組10只，低劑量及高劑量組每天灌胃竹葉石膏湯水煎液，模型組與正常組每天灌胃等體積生理鹽水，連續給藥14 d。

低劑量組用藥量為臨床人用藥量的6.25倍；高劑量組用藥量為臨床人用藥量的20倍；正常組及模型組每日灌胃生理鹽水，給藥體積均為4 ml。

1.6指標檢測

1.6.1行為學指標檢測 用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力〔12〕，①定位巡航實驗：給藥后10 d開始進行Morris水迷宮測試，連續訓練3 d，每天從4個不同象限中點將大鼠放入水池(頭朝池壁)，任其在水中游泳，讓其自行尋找平臺，爬上平臺后讓其在平臺上停留10 s，以使其強化記憶效果，若在60 s內未能爬上平臺，則由實驗人員將大鼠引導至目標平臺，同樣讓其在平臺停留10 s(平臺放置于第1象限，距圓點1/3處)。②空間探索實驗：定位巡航實驗結束后24 h，撤除平臺，進行空間探索實驗，將大鼠從原平臺對側象限中點放入，任其自由游泳90 s，用影像記錄系統記錄大鼠穿過原平臺所在位置的次數、目標象限停留時間及中心活動時間。

1.6.2生化指標檢測 于給藥后第9天進行口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)，大鼠禁食12 h后，灌胃2 g/kg葡萄糖溶液，分別于灌胃前(0 min)、灌胃葡萄糖溶液后30 min、60 min及120 min檢測大鼠血糖水平〔13〕。

于給藥后第14天行為學實驗結束后，大鼠摘眼球取血，分離血清，之后處死大鼠，迅速于冰面上分離海馬體，并用冷的生理鹽水制作1%海馬體組織勻漿，-20℃冷凍保存備用。按試劑盒指示檢測大鼠血糖、空腹胰島素水平，并檢測大鼠海馬組織TNF-α及Aβ1～42含量。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況觀察 與正常組相比，模型組大鼠的進食量、飲水量及尿量有升高趨勢且飲水量、尿量差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，低、高劑量組進食量、飲水量及尿量呈下降趨勢，且除低劑量組攝食量外差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 竹葉石膏湯對T2DM大鼠模型攝食量、飲水量及尿量的影響

2.2竹葉石膏湯對T2DM大鼠體重的影響 與造模前比較，造模后模型組及低、高劑量組大鼠體重均顯著下降(P<0.01)。給藥后，模型組體重持續下降，與造模后比較差異有統計學意義(P>0.05)；低、高劑量組與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但各組(除正常組)與自身造模后(即給藥前)體重相比明顯降低，但低劑量組大鼠體重降低比例最小。正常組各時間點體重差異無統計學意義(P>0.05)。 見表2。

表2 竹葉石膏湯對T2DM模型大鼠體重的影響

2.3竹葉石膏湯對T2DM大鼠模型OGTT的影響 給藥3 d后，正常組大鼠空腹血糖在正常范圍，口服定量葡萄糖后15 min升到峰值，30 min時恢復至正常水平；與正常組相比，模型組大鼠空腹血糖顯著升高(P<0.01)，口服定量葡萄糖后30 min血糖升至峰值，60 min時仍未恢復至空腹血糖水平，120 min時血糖濃度恢復至空腹血糖水平，各時間點血糖均顯著升高，與正常組比較均有顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，低劑量組大鼠空腹血糖顯著性降低(P<0.05)，但仍顯著高于正常組(P<0.01)，口服定量葡萄糖后15 min血糖水平達到峰值，30～120 min呈下降趨勢，但120 min時，血糖仍未恢復至空腹血糖水平，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較無顯著差異(P>0.05)；高劑量組大鼠空腹血糖基本恢復正常水平，與正常組比較無顯著差異(P>0.05)，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，口服定量葡萄糖后15 min血糖水平達到峰值，30～120 min呈下降趨勢，120 min時血糖濃度基本恢復至空腹血糖水平，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，與正常組比較無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 竹葉石膏湯對T2DM大鼠模型口服葡萄糖不同時間糖耐量的影響

2.4竹葉石膏湯對T2DM大鼠空腹血糖及胰島素水平的影響 與正常組比較，模型組空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)，空腹胰島素水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，末次給藥后，低、高劑量組大鼠空腹血糖水平均顯著降低(P<0.01)，血清胰島素水平有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 竹葉石膏湯對T2DM大鼠空腹血糖及血清胰島素水平的影響

2.5竹葉石膏湯對T2DM大鼠海馬TNF-α及Aβ1～42水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠海馬TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組大鼠海馬組織TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。海馬Aβ1～42水平檢測結果顯示，與正常組比較，模型組及各用藥組海馬Aβ1～42水平變化均不明顯，各組間比較均無顯著差異(P>0.05)。見表5。

表5 竹葉石膏湯對T2DM大鼠海馬TNF-α及Aβ1～42水平的影響

2.6竹葉石膏湯對T2DM大鼠學習記憶能力的影響 Morris水迷宮實驗檢測結果顯示，給藥14 d后，目標象限停留時間檢測結果顯示，與正常組比較，模型組及各用藥組，在原站臺所在象限(即目標象限)停留時間變化均不明顯，各組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組中心活動時間顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組大鼠中心活動時間顯著升高(P<0.01)，但高劑量組大鼠中心活動時間變化不明顯，與模型組比較無顯著差異(P>0.05)。與正常組比較，模型組大鼠穿越平臺次數顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組大鼠穿越平臺次數顯著升高(P<0.01)，同樣，高劑量組大鼠穿越平臺次數變化也不明顯，與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，見表6。

表6 竹葉石膏湯對T2DM大鼠學習記憶能力的影響

3 討 論

建立理想的糖尿病模型是糖尿病發病機制和臨床新藥研發的基礎，目前T2DM模型主要分為：自發型糖尿病模型動物、轉基因模型動物和誘發性糖尿病模型動物。其中自發型糖尿病模型與轉基因糖尿病模型動物因價格昂貴，飼養要求高，在國內較少應用〔14〕。誘發性糖尿病模型動物在國內應用較為廣泛，通常采用各種物理或化學的方法損傷部分胰臟或胰島 β 細胞導致胰島素分泌不足，同時結合高糖高脂飼料喂養，造成外周組織對胰島素不敏感，引起高血糖癥狀，病理生理改變符合人類T2DM〔15〕。 藥物誘導的糖尿病模型具有發病率高、造模時間較短，且價格低廉的優點。本實驗選用72周齡，雄性老年大鼠，高糖高脂飼料喂養1 w后，腹腔注射小劑量STZ，成功建立了T2DM大鼠模型，造模時間較短，價格低廉，病理生理改變符合人類T2DM發病過程，為T2DM動物模型的建立提供了新思路。

T2DM認知功能障礙的發病機制至今仍未能被完全闡明。現代醫學研究發現其發病原因可能與腦內代謝異常、Ca2+穩態失衡、炎癥因子、胰島素抵抗(IR)、Aβ1～42的過度表達、tau蛋白磷酸化、腦血管損傷、微血管、大血管病變及氧化應激與細胞凋亡等因素有關〔16〕。上述因素間的因果關系也是目前研究的熱點問題，Winocur等〔17〕與Kamal等〔18〕研究發現IR在T2DM大鼠記憶力下降的過程中起著十分重要的作用〔17,18〕。糖代謝紊亂會導致TNF-α水平升高，Aβ1～42發生非酶糖基化，形成糖基化終末產物，最終導致神經細胞損傷，甚至影響中樞神經系統功能，從而引起認知功能損傷〔19〕。周莉等〔20〕研究也發現存在認知功能障礙的糖尿病患者較非認知功能障礙糖尿病患者血清Aβ1～42水平顯著升高，說明Aβ1～42在T2DM患者體內的過度表達可能會導致T2DM認知功能障礙發病。

另一方面，炎癥反應也是糖尿病患者認知功能減退的重要原因之一〔21〕，臨床研究顯示：血清IL-6和TNF-α水平升高是T2DM患者認知功能下降的一個重要危險因素〔22〕。TNF-α是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產生的促炎細胞因子，當患者長期處于高血糖水平時，體內分泌的某些糖基化產物會激活巨噬細胞，使其分泌TNF-α，而過度表達的TNF-α會干擾胰島功能及糖代謝，進而造成神經的損傷，導致認知功能障礙〔22〕；另一方面，TNF-α還可以透過血腦屏障，通過促進海馬組織胰島素受體絲氨酸磷酸化，促進認知功能障礙〔23〕。

本研究結果說明竹葉石膏湯對T2DM有較好的改善作用，這一結果與裴晶等〔24〕的報道一致，竹葉石膏湯可能通過抑制炎癥因子的生成，改善糖尿病大鼠記憶力減退癥狀。意外的是，我們發現該方法誘導的T2DM大鼠海馬Aβ1～42水平變化并不明顯，竹葉石膏湯對海馬Aβ1～42水平的變化也沒有表現出明顯的抑制作用，這可能與糖尿病發病時間較短的原因有關，同時也說明T2DM大鼠認知功能障礙發生初期主要與炎癥反應有關。本實驗還發現，竹葉石膏湯高劑量組空腹血糖及海馬TNF-α水平均顯著降低，但學習記憶能力卻沒有顯著升高，推測可能是由于竹葉石膏湯中半夏的中樞神經麻醉作用所至〔25〕，有待進一步研究。