卡維地洛抑制心肌成纖維細胞增殖的作用

劉絮 張廣超 韓繁同 張雅 董寧 王立英

(1北華大學醫學院，吉林 吉林 132013；2吉林大學第一臨床醫院)

心血管疾病指因心臟及血管的病變而引發的一系列病癥，包括冠心病、高血脂、高血壓等，最終會引起心肌纖維化(MF)及心肌重塑。MF是臨床一種常見疾病，是指由于心肌成纖維細胞(CFbs)激活后出現的過度增殖、合成和分泌過量的細胞外基質(ECM)導致心肌組織中ECM的過度積聚，多種膠原蛋白發生成分的改變及其濃度增加。主要表現各型膠原比例的失衡、膠原含量增加、結構重排，影響心臟功能，終致心力衰竭發生。MF是多種心臟疾病發展的共同結局，導致心臟收縮功能障礙、心律失常及室顫的發生，最終引起難治性心力衰竭。CFbs的組成及其分泌物的改變在心肌重塑，尤其是心肌纖維化過程中發揮重要作用〔1〕。現有研究表明，第三代β受體阻滯劑卡維地洛(Car)不僅具有良好的降低血壓、抗氧化作用，還具有逆轉心肌重塑的作用〔2〕。本研究應用血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導新生大乳鼠CFbs增殖模型，通過對比細胞增殖率及免疫細胞化學染色后p-蛋白激酶(PK)Cα的表達量及光密度值來探討Car抑制MF的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1成纖維細胞增殖模型的制備

1.1.1原代培養 Wistar乳鼠，1～3日齡，無菌開胸取心臟，用預冷的D-Hank沖洗心臟2次后，將其剪成1 mm3的碎片，用胰蛋白酶(0.25%)多次消化(37℃的水浴，每次5 min)后收集上清液，1 200 r/min離心10 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的IMDM培養基重浮細胞，并將細胞接種于100 ml無菌培養瓶里，置于37℃、5% CO2孵箱內培養傳代。實驗采用第2～3代細胞。

1.1.2誘導CFbs增殖 IMDM培養基(10%胎牛血清)中用AngⅡ(10-7mmol/L)誘導成纖維細胞增殖，依據需要加入不同劑量Car，培養24～48 h。

1.2細胞增殖率 用胰酶(0.25%)消化處于對數生長期的成纖維細胞2 min，吹懸浮細胞制成IMDM(10%血清)培養基細胞懸液(每孔200 μl)，接種于96孔板(1×105個/ml)，每次加藥前無血清培養12 h，加藥后培育48 h。棄去上層液體，每孔加入20 μl噻唑藍(MTT)溶液(5 mg/ml)和IMDM培養基180 μl，37℃、5% CO2孵箱孵育4 h。再次棄去上層液體，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩10 min后在酶標儀(波長495 nm)上測其光密度(OD)值，細胞增殖率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3免疫細胞化學染色 (1)CFbs爬片：將無菌的蓋玻片放置于24孔細胞培養板中，將CFbs(105/ml)鋪板，各組加藥前無血清培養CFbs 12 h后再加入各劑量藥物，繼續培養CFbs 24 h進行指標檢測。(2)染色：用37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)反復清洗蓋玻片(5 min×3次)，多聚甲醛固定(4%，30 min)，蒸餾水沖洗3次，每次5 min，Triton(0.3%)孵育(37℃)帶有CFbs的蓋玻片20 min，再用PBS清洗3次，每次5 min。嚴格按照免疫組化試劑說明書操作檢測。二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色，置鏡下觀察2～3 min后用自來水沖洗玻片2次，每次3 min，再用蘇木素復染30 s，酒精-鹽酸溶液脫色，氨水反藍，清水沖洗多次。梯度乙醇脫水，二甲苯洗刷玻片2次，每次3 min，樹膠封片，應用Image-pro plus V5.0檢測OD值并進行定性定量分析。

1.4分組及給藥劑量 取對數生長細胞，隨機分為對照組，模型組，Car低、中、高劑量組，模型組細胞給予AngⅡ1×10-7mol/L培養，對照組不予任何處理，Car低、中、高劑量組細胞除給予AngⅡ1×10-7mol/L培養外，分別加入Car 1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 培養，細胞培養液為10%血清IMDM。

1.5統計分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1Car 對 CFbs 生長形態的影響 各處理組作用CFbs 24 h后，放在倒置顯微鏡下觀察CFbs形態變化。對照組CFbs胞體較大，胞質豐富，呈長梭形，細胞彼此連接豐富；模型組CFbs增生活躍，呈火焰狀，胞體增大，生長密集；加入Car后，CFbs密度逐漸降低，細胞體積縮小，呈梭形或圓形，間隙逐漸增大，細胞間連接逐漸減少，透光度降低，見圖1。

圖1 AngⅡ作用24 h后CFbs放置在倒置顯微鏡下的形態改變(×200)

2.2Car 對 CFbs增殖的影響 模型組細胞增殖率顯著高于對照組(P<0.01)，Car可抑制由AngⅡ誘導的成纖維細胞增殖(P<0.01)，見表1，成功建立CFbs增殖模型。

2.3Car 對 CFbs膜p-PKCα表達的影響 各處理因素作用CFbs 48 h后，模型組胞膜黃褐色顆粒較多且深染。Car 在 10-5～10-7mol/L可不同程度減少CFbs胞膜黃褐色顆粒數量，即p-PKCα的膜表達量減少，見圖2。模型組胞膜內p-PKCα OD值對照組顯著增高(P<0.01)。Car 10-5～10-7mol/L可顯著降低p-PKCα 胞膜染色OD值(P<0.01)，見表1。

表1 CFbs增殖百分率及p-PKCα平均光密度值

圖2 Car對CFbs的p-PKCα膜轉位及表達的影響(×200)

3 討 論

MF是指心臟組織中膠原纖維過量增殖。近年來大量研究證明高血壓、心力衰竭等心血管疾病可引起心肌細胞代償性增生，最主要的表現就是發生MF。心臟結構細胞中約2/3為非肌細胞，而非肌細胞中90%以上是成纖維細胞。成纖維細胞增殖后的直接結果是心臟結構的改變，導致心臟收縮、舒張功能減退和心肌的供血供氧的冠狀動脈儲備能力下降。如果心肌細胞長期處于功能的失代償狀態，容易引起患者猝死。有學者提出神經系統、內分泌系統失平衡后活化的AngⅡ、ET、ALD、熱休克蛋白(HSP)70等膠原合成因素參與膠原沉積及纖維化過程〔1,2〕，阻止MF的關鍵就是防止膠原合成因素的激活〔3〕。在腎素-血管緊張素系統中，肝臟合成的十四肽的Ang在腎臟球旁器中顆粒細胞分泌的腎素作用下，2個異亮氨酸間的肽鏈斷裂，生成AngⅠ，AngⅠ在血漿或組織中，尤其在肺臟循環血管內皮表面存在的血管緊張素轉換酶等作用下，苯丙氨酸與組氨酸間肽鏈斷裂，產生具有生理活性的AngⅡ(八肽)。AngⅡ及其受體的結合是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(引起心肌重塑的一個重要因素)激活的重要條件〔4〕。Car是一種臨床常用的治療原發性高血壓的藥物，在治療劑量范圍內，兼有α1和β受體阻滯作用，阻滯突觸后膜α1受體，會引起外周血管擴張、降低外周血管阻力；非選擇性阻滯β受體，抑制腎臟顆粒細胞分泌腎素，抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統功能。Car可通過以上兩個過程產生降低血壓的作用。有研究表明Car也可通過阻滯β1、β2和α1受體，在改善心功能的同時，降低腎上腺素能受體自身抗體的陽性率，并通過進一步研究證實其也可降低自身抗體的滴度，所以Car也被應用于臨床治療心力衰竭〔5,6〕。心力衰竭早期，機體主要通過激活腎上腺素能系統實現功能上的代償，可短時間內增強心肌收縮能力，并加快心率等增加心輸出量，有研究表明腎上腺素系統的激活加速心臟損傷，而Car可以通過阻滯腎上腺素能受體和降低自身抗體滴度來保護心肌細胞〔7〕。

研究表明，Ca2+通道阻滯劑、AngⅡ受體阻斷劑、AngⅠ轉換酶抑制劑及Adr受體阻斷劑等都具有抑制CFbs的增殖作用〔8〕。體內實驗發現多數藥物存在不良反應，限制了其臨床應用〔9～15〕。本研究發現Car不僅可以治療心力衰竭，還能夠抑制MF。臨床應用也證實Car副作用少，尤其對于糖尿病患者幾乎不影響自身糖類和脂類代謝〔8〕，近幾年Car已成為臨床治療和預防MF藥物的研發熱點。

PKC屬于蘇氨酸-絲氨酸激酶家族，現已被證實對多種心臟病理生理調控過程有關，細胞的很多功能如分化、增殖、死亡或形成腫瘤等與PKC家族密切相關〔10,12〕。通過免疫組化可以觀察到PKCα主要存在于細胞質中，但p-PKCα可以轉移到細胞膜內部，促發一系列細胞內的信號轉導，產生諸多生物學效應：參與細胞的分化、增殖；參與細胞后期遷移〔9,11,14〕，如心臟細胞〔12〕、人類視網膜細胞等〔11〕。心肌細胞肥大過程中PKC發揮十分重要的作用，其磷酸化多種激酶的前體，包括mTor、S6K1、MAPK、ERK等。綜上，推斷Car可能是通過抑制p-PKCα的膜轉位及表達，從而抑制CFbs增殖達到抗MF的作用。