氫離子阻斷CCL5-CXCL4異構體通過減弱白細胞募集和內皮增生改善心肌梗死后心功能的機制

詹莉 代菁 劉超

(1武漢市第八醫院心血管內科，湖北 武漢 430010；2江漢大學附屬醫院 武漢市第六醫院心電圖室；3天津市胸科醫院心血管病研究所)

心肌梗死(MI)是發達國家最常見的死亡原因之一，因此尋找新的預防和治療MI策略是首要任務。冠狀動脈粥樣硬化是血管阻塞后急劇缺乏血液供應導致心肌細胞死亡并引起許多炎癥因子的顯著上調。通過再灌注療法有效治療急性MI促進血流恢復至缺血心肌。低濃度氫氣或氫離子或氫氣飽和生理鹽水對多種疾病具有神奇的保護作用，包括心肌缺血再灌注損傷。炎癥反應在再灌注期間繼續損傷心臟組織，這可能導致進一步不可逆的心肌細胞死亡。炎癥反應也可用于制備心肌組織和修復駐留細胞〔1〕。最近顯示嗜中性粒細胞將巨噬細胞極化為修復表型，表明嗜中性粒細胞(白細胞的一種)在MI相關炎癥中的作用〔2～5〕。

趨化因子是與特異性G蛋白耦聯受體(GPCR)結合并發揮不同功能的小細胞因子，趨化因子能調節白細胞的活化并協調它們對炎癥部位的運輸〔6〕。趨化因子(CCL)5和血小板因子(CXCL)4儲存在血小板的分泌性α-顆粒中，是有效的中性粒細胞和單核細胞引誘劑〔7，8〕。此外，這些趨化因子顯示出嗜異性相互作用，CCL5-CXCL4異構體募集單核細胞和中性粒細胞方面特別有效〔9～12〕。由于CCL5的實驗性抑制在心肌再灌注期間顯示出心臟保護作用〔13～15〕，假設阻斷CCL5-CXCL4相互作用將在MI的早期階段具有治療益處，可能對MI具有治療效果。本研究評估了氫離子處理對心肌缺血再灌注小鼠模型中心肌組織和心臟功能的影響。

1 資料與方法

1.1實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠，10周齡，重約25 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養于空調室內，光照周期為12 h 20℃±2℃和50%～60%濕度，飲用水均經過滅菌處理。

1.2心肌缺血模型 實驗所用動物用5%異氟烷麻醉，在呼吸機支持下通過做中線頸部切口暴露左頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，用尼龍縫合線縫合頸總動脈，并將縫合線推進至頸動脈分叉處約9 mm處，以閉塞大腦中動脈(MCA)，心肌缺血60 min建立心肌缺血再灌注模型。在假手術組中，進行了相同的手術，但沒有將縫合線插入MCA。共有30只小鼠隨機分組，包括10只假手術小鼠和20只心肌缺血小鼠，用于整個實驗。所有實驗程序由廣東省醫學實驗動物中心批準，并且根據動物使用和護理指南進行實驗。

1.3實驗處理 將 20只心肌缺血小鼠隨機分為對照組與氫離子組，每組10只，對照組和假手術組采用預先用氧平衡(體積分數95%O2+5%CO2)的37℃空白灌流液(K-R液)灌注，氫離子組采用預先用氧平衡(體積分數95%O2+5%CO2)的37℃ K-R液+氫離子灌注(0.6 mmol/L pH7.3)。實驗完畢后取材，伊文藍染色觀察兩組大鼠心肌組織的心肌病理學改變，測定心肌組織中白細胞和內皮細胞數量。

1.4研究方法

1.4.1RNA提取和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析 使用TRIzol試劑(Invitrogen)分離總RNA。使用Prime-Script RT試劑盒(日本TaKaRa公司)合成逆轉錄的互補DNA。常規PCR用于使用特異性正向引物測定miRNA表達，并且使用小核RNA互補的通用反向引物作為內部對照。CCL5和CXCL4的PCR引物設計：CCL5：上游引物TCAGGTCATCACTATCGGCAAT，下游引物AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA；CXCL4：上游引物CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物TTTAATGTCACGCACGATTTC ；β-actin：上游引物AACAGTCCGCCTAGA AGCAC，下游引物CGTTGACATCCG TAA AGACC，PCR循環通過在95℃下初始變性進行5 min，然后在95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min條件下完成35個循環，最后72℃ 1 min。

1.4.2CCL5/CXCL4表達量的檢測 為了檢測氫離子處理后心肌缺血小鼠中CCL5-CXCL4異構體的表達水平，在灌注后10 h收獲樣品，在冷裂解緩沖液(10 mmol/L 4-2-羥乙基-1-哌嗪-乙磺酸〔pH 7.9〕，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L二硫蘇糖醇)和蛋白酶抑制劑混合物(德國RocheDiagnostics GmbH公司)中輕輕勻漿，然后離心，收集上清液并用于分析。使用二辛可寧酸(美國Pierce公司)測量蛋白質濃度。將蛋白質(36 μg)加載到每個泳道中，用4%～15%聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Rad公司)分離，并電轉移至聚偏二氟乙烯膜(美國MILLIPORE公司)。用含有0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的5%脫脂奶粉封閉膜1 h，并與1∶250抗小鼠CCL5抗體(美國R&D Systems Inc公司)一起溫育過夜。用PBS中的0.1%吐溫洗滌3次，然后在室溫下與1∶1 000二抗(美國Cell Signaling Technology公司)一起溫育2 h，并用0.1%Tween的PBS溶液洗滌3次。用ECL試劑(瑞典Amersham Biosciences公司)檢測信號。β-肌動蛋白用作內部對照。用Image J軟件進行條帶的光密度分析。

1.4.3流式細胞儀統計白細胞和內皮細胞數目 在灌注后10 h用過量的異氟烷對小鼠實施安樂死，并用50 ml冷PBS灌注。使用3 ml緩沖液(含有1%胎牛血清的PBS)與3 ml 90%細胞分離液〔通用電氣(中國)有限公司〕混合在冰上收集他們的心肌細胞，細胞懸浮后加入1 ml 70%細胞分離液，然后將樣品在4℃下以1 500 r/min離心30 min，收集白細胞并用緩沖液洗滌，然后將細胞重新懸浮用于統計。

1.4.4伊文氏藍/四唑染色法 為了評估梗死面積的大小，從對照組和氫離子組(每組10只)中分別切下心臟并用PBS洗滌，灌注200 μl伊文藍。在-20℃下冷凍1 h后，將心臟切成5個切片，并在四氮唑溶液中于37℃孵育10 min，然后在10%甲醛中溫育10 min。將切片固定在顯微鏡載玻片之間用于照相和測量。使用Image J測量包含藍色正常區域，紅色受傷但仍存活區域和白色梗死區域的總腦室面積。缺血區(AAR)計算為總染色區域和藍染區域之間的差異，并表示為總腦室的百分比梗死面積計算為白色未染色區域。

1.4.5超聲心動圖 在小動物超聲成像儀(日本富士VisualSonics公司)上進行二維和M模式超聲心動圖測量。兩種程序均在心肌缺血再灌注后進行。用含1.5%異氟烷的面罩麻醉小鼠，并置于溫熱墊上的仰臥位。記錄和分析射血分數，心輸出量，左心室舒張末期(LVEDD)，左心室收縮末期(LVESD)直徑，心率和心臟重量。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1CCL5和CXCL4 mRNA的表達 與對照組(0.37±0.01、0.31±0.01)比較，氫離子組CCL5和CXCL4的表達量顯著降低(0.29±0.01、0.25±0.02；χ2=9.170、7.852，P=0.008、0.015)，說明氫離子能夠阻斷CCL5和CXCL4的表達。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測mRNA表達

2.2CXCL4-CCL5異構體的表達量 氫離子組CXCL4-CCL5表達量(0.29±0.01)顯著低于對照組(0.37±0.013,t=9.17,P=0.008)，說明氫離子能夠降低CXCL4-CCL5異構體的表達，阻止CXCL4-CCL5異二聚體的形成。見圖2。

圖2 CXCL4-CCL5異構體蛋白表達

2.3白細胞和內皮細胞數目 與對照組〔(19.47±2.13)×104、(33.26±89.74)〕相比，氫離子組中白細胞和內皮細胞的數目均顯著下降〔(9.01±2.03)×104、(28.74±85.35)；P<0.05〕，說明白細胞和內皮細胞參與氫離子阻止CXCL4-CCL5異二聚體的形成過程。

2.4氫離子對心肌細胞存活和梗死面積的影響 伊文氏藍染色顯示氫離子組與對照組相比梗死面積明顯減小，心肌細胞存活區域顯著增多(P<0.01)，見表1、圖3。說明氫離子對心肌缺血有保護作用。

圖3 心肌細胞

表1 各組實驗動物心肌細胞存活和梗死面積比較

2.5氫離子對MI后心功能的影響 與對照組相比，氫離子組射血分數和心輸出量顯著增加，心率和心臟重量變化差異無統計學意義，左心室舒張(LVEDD)和收縮(LVESD)末期內徑顯著減小，用氫離子治療的心臟沒有擴張，說明了氫離子對MI后的心功能有積極的作用。見表2。

表2 超聲心動圖評估不同處理組心臟功能

3 討 論

MI發生后，心肌每天從循環系統招募數十萬白細胞，骨髓造血系統也迅速啟動造血生成，同時交感神經也會刺激造血祖細胞遷移至脾臟，產生骨髓外造血，分化出大量白細胞，進一步促進炎癥的產生，加重心室重構，造成巨大危害。因此，研究MI發生后對白細胞生成的影響，對抑制MI后炎癥加重有重要的臨床意義。

本研究證明了氫離子能夠特異性阻斷CCL5-CXCL4相互作用，用于治療心肌缺血/再灌注損傷。由于MI后炎癥減少，給予氫離子顯著減少了梗死面積。用氫離子治療后，中性粒細胞和單核細胞浸潤到受影響的心肌區域減少，這對梗死結果和心臟功能產生積極影響。循環單核細胞在MI后以不同的波形滲入受影響的組織，經典的Ly6Chi CCR2+單核細胞負責清除死細胞和Ly6Chi CCR2-單核細胞用于組織修復，此外，在健康的穩態條件下，心臟組織中充滿了常駐巨噬細胞。在心臟，肝臟和腦中組織駐留巨噬細胞起源于胚胎卵黃囊衍生的前體。在穩態條件下，發現心臟主要由駐留的卵黃囊衍生的巨噬細胞Ly6Clow CCR2-細胞填充，其通過局部增殖自我維持，但各個趨化因子對常駐巨噬細胞的作用尚不明確。本研究觀察到用氫離子處理后心臟單核細胞含量降低。我們無法區分常駐細胞和浸潤細胞，因為Ly6Clow CCR2-單核細胞在急性缺氧事件后發生在梗死區域。由于梗死區域通過心臟的特殊分布(缺血/再灌注損傷的特征)，氫離子治療后梗死面積的顯著減少允許遠端心肌補償丟失的組織，從而保持區域收縮性和心臟功能。心肌具有復雜的細胞結構，除了心肌細胞外，還包括成纖維細胞和整合在毛細血管中的內皮細胞。在缺氧期間，內皮細胞重新組織并開始由MI后直接釋放的血管生成因子控制的血管生成，而成纖維細胞開始增殖〔16〕。然而，如本研究中的發現所示，心肌細胞正在經歷凋亡或甚至壞死。

在所有趨化因子中，趨化因子CCL5在心血管疾病中起特殊作用。CCL5介導單核細胞和T淋巴細胞通過內皮的阻滯和遷移。動脈粥樣硬化病變的進展是通過減少梗死后的趨化因子寡聚化〔17〕和心肌損傷，通過減少受影響心肌細胞中白細胞浸潤，趨化因子表達和細胞凋亡〔13〕。該結果表明，氫離子對異構體形成的抑制減少了心肌損傷，中性粒細胞和單核細胞浸潤到受影響的組織中的程度與CCL5拮抗劑或阻斷抗體完全抑制相似〔15〕。CXCL4在血小板聚集期間從活化血小板的α-顆粒釋放，并且可以通過與肝素樣分子結合來調節血液凝固。CXCL4已被公認為巨核細胞生成和血管生成的生理抑制劑，而不是經典的白細胞募集趨化因子。盡管如此，CXCL4可能會促進炎癥，尤其是心血管疾病。例如，CXCL4的遺傳缺失減少了小鼠的動脈粥樣硬化斑塊和新內膜形成〔18〕。研究表明，CXCL4可作為平滑肌細胞的促炎和促有絲分裂因子，促進血管損傷后的重塑〔12〕。在急性冠狀動脈綜合征期間，患者血清CXCL4水平升高，與心肌損傷的嚴重程度相關。在機制水平上，CXCL4對CCL5功能的增強似乎主要由CCR1介導，這與CCR1在心肌缺血/再灌注損傷中的作用一致〔8〕。因此，CXCL4似乎在CCL5介導的CCR1激活中起輔助作用，這一功能可能對CCL5的體內活性至關重要。最近的研究也支持這一觀點，該研究在炎癥性疾病的小鼠模型中實施了氫離子。例如，氫離子顯示抑制腹主動脈瘤的形成和進展，減少主動脈直徑增大，保留內側彈性蛋白纖維和平滑肌細胞，并減弱壁畫巨噬細胞浸潤，血管生成和主動脈金屬蛋白酶2和9表達。已知心肌細胞表達CCL5，并且向心肌細胞中添加CCL5顯著降低了肌細胞的收縮性。由于趨化因子CCL5和CXCL4通過異構化發揮特定功能，因此通過氫離子阻斷它不應改變這些趨化因子的水平，但它確實阻斷了異構體的功能。 氫離子的處理減少了單核細胞向缺血細胞的浸潤。