NIPT-plus 在無創(chuàng)產前檢測CNV 中的臨床價值分析*

丁昭寧，白文學，劉文蘭，劉靜，王曉玲，李楊，蘇健，鄧翠平

（重慶市江津區(qū)婦幼保健院產科，重慶402260）

染色體拷貝數(shù)變異（chromosome copy number variation，CNV）是引起人類遺傳變異的重要形式之一， 其廣泛存在于人類基因組之中。 研究顯示，CNV 是由于基因組重排引起的結構變異， 多表現(xiàn)為亞顯微水平基因組片段的微重復/微缺失等[1]。目前， 多種侵入性篩查手段在產前檢查中能夠檢出染色體微重復/微缺失，如核型分析、比較基因組雜交、熒光原位雜交及微陣列技術等，不過此類檢查手段存在一定的流產風險[2,3]，臨床應用存在一定局限性。 對此，尋找一種高精度且非侵入性的產前檢測手段以提高CNV 檢出率具有重要臨床價值。 本研究通過收集近年收治的接受無創(chuàng)產前基因檢測（NIPT-plus）孕婦的臨床資料，并與羊水細胞染色體核型分析結果進行一致性比較，旨在觀察NIPTplus 在無創(chuàng)產前檢測CNV 中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年3 月-2020 年3 月在江津區(qū)婦幼保健院產檢中接受NIPT-plus 檢測孕婦1014 例作為研究對象，年齡24-43 歲，平均（33.1±5.2）歲；孕周13-27 周，平均（22.3±1.0）周。 納入標準：孕婦為B 超軟指標異常、高齡妊娠（分娩年齡≥35 歲）、 血清學產前篩查高風險或臨界風險者，懷疑胎兒CNV；均經孕婦同意并簽署知情同意書后采集其外周血作為檢測樣本；排除標準：多胎及雙胎妊娠者；孕婦1 個月內接受過免疫治療、干細胞治療、 移植手術者及一年內接受過異體輸血者。 本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準后實施。

1.2 方法

1.2.1 NIPT-plus 檢測 ⑴樣本采集：采用EDTA 抗凝管采血管抽取孕婦7-10ml 外周靜脈血，在預冷離心機（4℃）內以1600r/min 的速率離心10min，收取上層血漿，并對初步分離的血漿再次離心，目的在于去除殘存細胞。⑵提取游離DNA：采用磁珠法從合格血漿樣本中裂解、 分離、 純化并提取游離DNA，提取游離DNA 過程中需建立標準的質量控制體系，確保所提取的游離DNA 質量合格，能夠滿足下一步實驗要求， 并確保其片段多態(tài)性有足夠代表性。 ⑶制備測序文庫：提取好的DNA 進行末端修復、補平，并進行測序接頭、擴增及純化，文庫的制備要嚴格按照標準流程進行， 文庫構建后的DNA 濃度要大于0.2ng/mg， 同時片段長度要在150-200bp 范圍內[4]。⑷基因測序及數(shù)據(jù)分析：采用NextSeq CN500 高通量測序儀檢測分析特定DNA片段的堿基序列， 并采用生物信息工具放大并分析不同染色體水平差異， 識別胎兒染色體非整倍體異常及相對高發(fā)的幾種微缺失疾病， 最終確定胎兒罹患染色體非整倍性疾病種類及風險概率。對NIPT-plus 檢測結果為高風險者進行遺傳咨詢，并征得孕婦知情同意前提下進行介入產前診斷。

1.2.2 羊水染色體核型分析 通過超聲引導定位，然后經腹羊膜腔穿刺抽取孕婦羊水20ml， 離心后取0.5ml 沉淀、培養(yǎng)，得到分裂中期細胞，然后經過低滲、固定、吉姆薩染色等處理，最終進行染色體核型分析。

1.2.3 隨訪 通過電話或查閱本院電子病歷記錄等方式隨訪NIPT-plus 檢測陰性孕婦的妊娠結局，包括有無流產、新生兒是否異常等。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0 軟件做數(shù)據(jù)分析，用n(%)表示計數(shù)資料，并計算NIPT-plus 檢查胎兒CNV 的陽性預測值。

2 結果

2.1 NIPT-plus 檢測結果及陽性預測值 本組1014例高風險或B 超軟指標異常孕婦經NIPT-plus 檢測，共檢出18-三體高風險3 例，21-三體高風險4例，13-三體高風險1 例， 微缺失3 例， 微重復2例，XO 高風險1 例，XXY 高風險1 例，45，XO 高風險1 例， 詳見表1。 羊水染色體核型分析確診為18-三體高風險3 例，陽性預測值100.0%；確診為21-三體高風險4 例，陽性預測值100.0%，確診為13-三體高風險1 例，陽性預測值100%，確診為微缺失/微重復3 例，陽性預測值60%，確診為性染色體異常2 例，陽性預測值66.7%。

2.2 隨訪結果 本組接受NIPT-plus 檢測為陰性的998 例孕婦均獲得隨訪并獲知妊娠結局，無流產現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)新生兒染色體異常現(xiàn)象。

3 討論

NIPT 是一種通過對孕母外周血胎兒游離的基因（DNA）進行測序及生物信息分析的新方法，其在篩查胎兒染色體非整倍體患病風險方面可提供重要依據(jù)[5,6]，具有無創(chuàng)、靈敏度高等優(yōu)點，近年來已逐步在臨床推廣應用。 NIPT 以檢測21-三體、18-三體、13-三體等疾病為主要目標， 其檢測準確性幾乎達100%，不過對于染色體微重復/微缺失綜合征缺乏有效的篩查指征[7,8]。 值得慶幸的是，貝瑞和康生物公司近年推出了升級版NIPT（NIPT-plus），其通過加深測序深度并以創(chuàng)新性的生物信息學算法大大增加了檢測范圍， 使得CNV 的檢出率明顯升高[9,10]。 目前，關于NIPT 在21-三體、18-三體、13-三體等疾病診斷中的價值研究較多， 但關于NIPT-plus 在胎兒染色體微重復/微缺失中的評估價值尚鮮有報道。

本研究結果顯示，1014 例風險樣本接受NIPT-plus 檢測后共檢出18-三體高風險3 例，21-三體高風險4 例，13-三體高風險1 例， 微缺失/微重復5 例，性染色體非整倍體3 例，經過核型分析顯示，NIPT-plus 在檢測18-三體、21-三體、13-三體中的陽性預測值均達100.0%， 與文獻報道結果基本吻合[11,12]，其對微缺失/微重復的陽性預測值為60.0%， 性染色體異常陽性預測值為66.7%， 提示NIPT-plus 檢測在評估CNV 風險方面有確切價值，但仍存在一定局限。 從本研究結果來看，NIPTplus 在檢測微缺失/微重復及性染色體異常中均存在假陽性病例，分析可能原因為：首先，限制性胎盤嵌合、母體染色體嵌合、性染色體互換、胎盤滋養(yǎng)層細胞等因素均有可能導致NIPT-plus 提示性染色體非整倍體高風險[13]；其次，NIPT-plus 檢測中也會受到孕婦自身異常DNA 的干擾[14,15]，從而導致無創(chuàng)結果與核型分析結果不符。 本研究中1 例微重復病例及1 例XO 高風險病例與核型分析結果不一致， 經隨訪發(fā)現(xiàn)孕婦繼續(xù)妊娠且新生兒出生后未發(fā)現(xiàn)異常， 出現(xiàn)假陽性可能是因為此2 例患者是由于染色體微小片段的重復或異常所致，而NIPT-plus 檢測可能對此還不夠靈敏， 這提示NIPT-plus 檢測還存在技術本身上的缺陷或不足。本研究的主要目的在于觀察NIPT-plus 檢測在提高產前CNV 篩查的準確性中的臨床價值， 從而為降低產前診斷的技術風險提供依據(jù)，NIPT-plus 的無創(chuàng)性、準確性獲得診斷醫(yī)師的普遍認可，不過其也存在假陽性，且費用較高，可能造成產前過度診斷， 因此建議在臨床中可作為高風險孕婦產前篩查的一種有效補充。 同時，本研究樣本量較少，故所得結果還需加大樣本量進一步驗證。

綜上所述，NIPT-plus 作為NIPT 的升級版，其在CNV 的檢測中對常見疾病如18-三體、21-三體中的陽性預測值較高，而在微缺失/微重復、性染色體異常等的檢測中陽性預測值尚有待提高， 希望隨著檢測技術的提高，NIPT-plus 在有效指導優(yōu)生優(yōu)育方面發(fā)揮更大作用。

表1 NIPT-plus 與羊水染色體核型分析結果比較