痛風及高尿酸血癥患者HLA-B*5801 基因攜帶情況及其與別嘌醇過敏反應間的相關性研究*

張衛忠，施春花，王友蓮

(江西省人民醫院風濕免疫科，南昌330006）

別嘌醇是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑， 能有效減少尿酸合成，作為降尿酸藥物療效顯著、價格低廉，在臨床上廣泛用于治療高尿酸血癥、痛風和痛風性關節炎等疾病。 然而在使用過程中，別嘌醇容易引起各種不良反應，有常見的藥疹、發熱、肝腎功能損害及血液系統損害[1]；也有嚴重的皮膚不良反應， 如中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)、 重 癥 滲 出 性 多 形 紅 斑 藥 疹(Stevens-Johnson syndrome，SJS) 及超敏綜合征(hypersensitivity syndrome，HSS)等，發病率約5%，病死率高達30%-50%[2]。 近年來，別嘌醇的過敏反應成為國內外學者關注的熱點。 2005 年，Hung 等[3]報道臺灣人群使用別嘌醇治療而產生嚴重不良反應與HLA-B*5801 等位基因之間存在相關性， 隨后國內外文獻[4-7]也有相關報道。2013 年的《高尿酸血癥和痛風治療中國專家共識》中推薦痛風及高尿酸血癥患者使用別嘌醇前檢測HLA-B*5801 基因。最新的美國臨床藥理學治療指南[8]也提出在口服別嘌呤醇之前對患者進行HLA-B*5801 基因型檢測是很有必要的， 等位基因型陽性者不主張服用別嘌醇，建議服用其他替代藥物。 但是不同地區、國家、 種族之間，HLA-B*5801 基因攜帶情況以及其別嘌醇相關藥疹之間的關聯性差異很大， 而且中國很多地區缺乏HLA-B*5801 基因攜帶情況的研究分析， 尤其是江西省內各地區缺乏該基因流行性的調查。而且很少有醫院開展該基因檢測。由于HLA-B*5801 基因檢測比較昂貴， 很多痛風及高尿酸血癥患者考慮經濟原因對該項檢測比較顧慮。 本研究希望通過調查南昌市痛風及高尿酸血癥患者HLA-B*5801 基因攜帶情況及與別嘌醇相關藥疹之間的相關性， 來指導本地痛風及高尿酸血癥患者選用合適藥物治療。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象為在2018 年6 月至2019年1 月期間就診于江西省人民院的痛風及高尿酸血癥患者。 其中痛風的診斷標準參考2015 年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯盟痛風分類標準[9]；高尿酸血癥診斷標準： 男420μmol/L （7mg/L）， 女360 μmol/L（6mg/L）。入選患者年齡18-75 歲。將服用別嘌醇的痛風及高尿酸血癥患者分為兩組， 其中服用別嘌醇而過敏的11 例患者納入別嘌醇過敏組；服用別嘌醇超過6 個月但未發生任何不良反應的患者21 例納入別嘌醇耐受組；在江西省人民醫院就診且未服用過別嘌醇的痛風及高尿酸血癥患者共80 例納入對照組。 詳細記錄受試者的相關資料，包括性別、年齡、家庭住址、民族、臨床診斷、藥物使用情況、 出現的藥物不良反應情況及相應的治療情況等。 所有受試者均知情同意并簽署了知情同意書，且通過醫院倫理委員會的審核批準。

1.2 方法 使用EDTA 抗凝管采集各受試者靜脈血3mL，提取血液DNA，并測定DNA 濃度和純度，利用安徽同科生物科技有限公司的人類HLAB*5801 基因檢測試劑盒（PCR 多色熒光法） 進行HLA-B*5801 等位基因檢測。 其中該試劑盒針對HLA-B*5801 等位基因設計了一套特異性引物和探針組合， 在一個反應體系中利用兩熒光通道檢測目標基因。 在反應體系含有對應基因型模板的情況下，PCR 反應得以進行，并利用熒光定量PCR儀對反應過程中釋放出的相應熒光信號進行實時檢測和輸出，實現HLA-B*5801 等位基因的檢測。其中JOE 熒光為內參基因信號，ROX 和FAM 為HLA-B*5801 等位基因信號。檢測過程中所有操作均由經培訓后的專人嚴格按照試劑盒說明書進行。

結果判讀：FAM、JOE 和ROX 的Ct 值均≤38，HLA-B*5801 陽性； 其中JOE≤38，FAM 或ROX不均≤38，HLA-B*5801 陰性；若JOE（內參）Ct 值＞38，可能存在PCR 抑制，需對樣本進行復測。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析， 計數資料比較采用Fisher確切概率法和卡方檢驗。HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過敏間的關聯強度使用比值比 （odds ratio,OR）和95%可信區間（confidence interval,CI）反映。P＜0.05 為差異有統計學意義。HLA-B*5801 等位基因陽性判斷別嘌醇過敏的敏感度=別嘌醇過敏組HLA-B*5801 陽性數/別嘌醇過敏組總人數×100%；HLA-B*5801 等位基因陰性判斷別嘌醇耐受的特異度=別嘌醇耐受組HLA-B*5801 陰性數/別嘌醇耐受總人數×100%。

2 結果

2.1 HLA-B*5801 等位基因檢測情況 所有受試者的內參基因（JOE）全部擴增，且Ct 值均＜38，受試者檢測結果根據HLA-B*5801 檢測試劑盒的說明書進行判讀。 112 位受試者中，HLA- B*5801 等位基因陽性23 例（占20.5%），其中男性有16 例，女性7 例；HLA- B*5801 等位基因陰性89 例（占79.5%），其中男56 例，女33 例，檢測結果見表1。

表1 HLA-B*5801 等位基因檢測情況n（%）

圖1 HLA-B*5801 基因檢測擴增圖（左：陽性/右：陰性）

在檢測結果中， 隨機選取了HLA-B*5801 等位基因陽性、陰性的擴增結果各1 例，見圖1。由圖知，兩受試者的內參基因（JOE）熒光通道均有曲線擴增，Ct 值在34 左右，小于38，檢測有效，其中一受試者的HLA-B*5801 基因（FAM 和ROX）熒光通道有擴增曲線，Ct 值在32 左右， 小于38，HLAB*5801 等位基因陽性； 而另一受試者的HLAB*5801 基因（FAM 和ROX）熒光通道無擴增曲線，HLA-B*5801 等位基因陰性。

2.2 別嘌醇過敏與HLA-B*5801 基因相關性 別嘌醇過敏組受試者HLA-B*5801 等位基因陽性率為90.9%（10/11）， 別嘌醇耐受組受試者HLAB*5801 等位基因陽性率為9.5%（2/21），對照組受試者HLA-B*5801 等位基因陽性率為13.8%（11/80）； 別嘌醇過敏組與別嘌醇耐受組比較，HLAB*5801 等位基因陽性者發生別嘌醇過敏的風險是HLA-B*5801 等位基因陰性者的95 倍 （OR=95，95% CI:7.6-1180.3，P＜0.001）， 該基因陽性判斷別嘌醇過敏的敏感度為90.9%，該基因陰性判斷別嘌醇耐受的特異度為90.5%。別嘌醇過敏組與健康對照組比較，HLA-B*5801 等位基因陽性者發生別嘌醇過敏的風險是HLA-B*5801 等位基因陰性者的62.7 倍（OR=62.7，95% CI:7.3-539.5，P＜0.001）（表2）。

3 討論

表2 各組攜帶HLA-B*5801 等位基因情況

在本研究中,健康對照組HLA-B*5801 等位基因陽性率為13.8%, 與國內人群的陽性率14%-20%[3-5]相似，顯著高于歐洲（0.8%）及日本（0.6%）[2]，但低于曾大勇[10]等的研究(20.4%)，與不同地區人群的HLA-B*5801 等位基因攜帶率有差異理論相符[11]。 關于不同地區有不同的攜帶率的研究，后續可針對不同地域區內的受試者進行深入探究。HLA-B*5801 該標志基因的危險度（OR=95）低于Hung 等[3]（OR=580.3）及高杰等[2]（OR=403），但 高于曾大勇等[10]（OR=65.6），可能與研究的樣本數量及區域位置有關， 該研究證明HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過敏之間有關聯。

研究所用的實時熒光定量PCR 技術是在反應體系中加入針對HLA-B*5801 等位基因設計了一套特異性引物和探針組合， 且反應體系中加入了對內參基因的檢測，能夠更好的對樣本DNA 的提取及擴增進行監控，避免假陰性結果，提高試驗數據準確性。 熒光定量PCR 比常規PCR 特異性更強、靈敏度更高、分析結果快速，而且整個PCR 反應過程均在完全閉管狀態下進行， 無需冗長的后處理， 有效避免了常規PCR 產物造成的潛在實驗室污染問題。

近年來，由于肥胖、腎功能不全及高血壓發病率逐年上升,高尿酸血癥及痛風的發病率也隨之上升。根據《2016 年中國痛風指南》[12]，我國不同地區,不同時間段痛風患病率在1%-3%， 且呈逐年上升趨勢[13]。別嘌醇作為降尿酸、治療痛風的一線藥物，特別受人們的青睞,然而別嘌醇引起的嚴重過敏反應成為臨床應用的難題。 在江西地區，痛風及高尿酸血癥的發病率高, 但存在很多患者未規律就診，包括不規范使用藥物及監測血尿酸指標等。 在使用別嘌醇前很少患者曾檢測過HLA-B*5801 等位基因，存在用藥風險[14]。 本研究及其他研究[2-3,5-7,15,16]都已證實HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過敏有很強的相關性， 且HLA-B*5801 等位基因陽性率在亞裔漢族人群中具有相當高的比例[14]，對即將服用別嘌醇的病患者進行HLA-B*5801 等位基因的檢測，有助于降低別嘌醇過敏反應的發生，指導患者安全合理用藥。