HMGB1 及其受體RAGE 在橋本甲狀腺炎患者中的變化及臨床意義*

饒歡歡，華琳，劉曉峰，溫洪周，薛國輝

（江西省九江市第一人民醫院檢驗科，九江332000）

橋本甲狀腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）是一類最常見的自身免疫性甲狀腺疾病， 其主要病因學為甲狀腺功能減退[1]。 而其特征為血清甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroperoxidase antibody，TPOAb)和甲狀腺球蛋白抗體 （thyroglobulin antibody，TgAb）異常升高[2]。 雖有研究報道發現遺傳易感性和環境因素參與本病的發生發展， 但至今其詳盡的發病機制尚不清楚[3]。 既往研究證實HT 患者甲狀腺組織中浸潤淋巴細胞， 尤其是輔助性T 細胞17（T helper cell 17, Th17），這些炎性細胞浸潤會引起甲狀腺濾泡破壞， 此外外周血中也發現Th17細胞上調而調節性T 細胞（Regulatory cells, Treg）細胞顯著下調[4,5]。 Th17/Treg 軸平衡對于維持機體免疫穩態至關重要，已在多種自身免疫性疾病中發現其存在異常， 據此推測Th17/Treg 軸紊亂在HT中扮演重要角色。但何種分子參與調控HT 中這一紊亂并不清楚。 高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）與其受體晚期糖基化終產物受體 （receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）結合共同作用參與免疫系統調控，其中比較重要的即為參與Th17/Treg 軸調控[6]，已有報道其在系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎等疾病中異常表達[7]，但其是否在HT 患者中發生變化且是否與Th17/Treg 存在關聯，目前未見相關報道。 據此，本研究將檢測HT 患者HMGB1 和RAGE 表達變化及其與Th17 和Treg 效應細胞因子IL-17、IL-10 表達的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018 年3 月至2019 年12 月間于九江市第一人民醫院內分泌科就診且明確診斷為HT 的初診患者35 例，其中女27 例，男8 例。所有HT 患者均為門診患者，診斷依據甲狀腺彩色多普勒超聲和血清TPOAb 和TgAb，參考中華醫學會內分泌學分會制定的 “成人甲狀腺功能減退癥診治指南”[8]。 排除標準：⑴合并其他自身免疫性疾病；⑵合并腫瘤；⑶合并慢性腎臟病、糖尿病和感染性疾病； ⑷就診前3 個月內使用影響甲狀腺功能或免疫系統的藥物；妊娠期或哺乳期女性患者。同時選取30 例同期健康體檢人群作為本研究對照組，其中女24 例，男6 例，健康人群除滿足以上排除標準，還應排除甲狀腺疾病。

1.2 血液標本采集和處理 采集35 例HT 患者和30 例體檢人群入院當日空腹靜脈血6ml，分裝于2個干燥管中,每管3ml,室溫靜置20min 后，3000rmp 15min 離心分離血清。 其中一管立即送檢，用于甲狀腺功能五項測定。另一管分離血清,凍存至-80℃,用于酶聯免疫吸附試驗測定血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 的測定。

1.3 甲狀腺功能五項測定 采用羅氏combas e601全自動電化學發光儀及配套試劑測定血清FT3、FT4、TSH、TPOAb 和TgAb 濃度。 各指標參考范圍如下：FT3：3.1-6.8pmol/L，FT4：11.48-22.70pmol/L，TSH：0.20-7.0μIU/L，TPOAb：0-34 IU/mL，TgAb：0-115 IU/mL。 檢驗前保證儀器室內質量控制在控。

1.4 血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 測定 血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 均采用酶聯免疫吸附試驗測定。 Human HMGB1 ELISA Kit(DEIA6297)、Human RAGE ELISA Kit (DEIA2687)、Human IL-17 ELISA Kit (DEIA7983)和Human IL-10 ELISA Kit (DEIA116) 均購自美國Creative Diagnostics 公司， 分別用于血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 測定。 所有實驗步驟嚴格依據試劑盒說明書執行。

1.5 統計學分析 所有實驗數據采用SPSS 25.0 軟件分析，計量資料采用均數±標準差（±s）形式表示，組間差異采用獨立樣本t 檢驗。 指標間相關性采用Spearman 法進行分析。以P＜0.05 視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HT 患者和對照組一般資料比較 與健康對照組相比，HT 患者具有更低水平的TSH， 以及更高水平的TPOAb 和TgAb。而兩組間年齡、性別構成、BMI、FT3 和FT4 間差異均無統計學意義。 見表1。

表1 HT 患者和對照組一般資料比較

2.2 HT 患者和對照組血清HMGB1、RAGE、IL-17和IL-10 比較 與健康對照組相比，HT 患者HMGB1 和RAGE 均顯著上調, 差異具有統計學意義（P＜0.05）。此外，HT 患者血清IL-17 水平亦顯著高于對照組， 而IL-10 則顯著低于健康對照組（P均＜0.05）。 見表2。

表2 HT 患者和對照組血清HMGB1、RAGE、IL-17 和IL-10 比較

2.3 HT 患 者 血 清HMGB1 和RAGE 與TSH、TPOAb、TgAb、IL-17 和IL-10 的 相 關 性 分 析Spearman 相關性分析發現，HT 患者血清HMGB1與TSH、TPOAb 和TgAb 間相關性并不顯著， 而與IL-17 濃度呈顯著正相關性，而與IL-10 水平呈顯著負相關性。 而血清RAGE 與TSH、TPOAb、TgAb和IL-10 間均無顯著相關關系，而與IL-17 呈顯著正相關關系。 見表3。

3 討論

既往研究表明HT 發病機理與免疫平衡紊亂相關, 其中CD4+T 細胞活化被認為扮演重要角色[9]。 Th17 細胞是CD4+T 細胞中一類在炎癥反應中極為關鍵的亞群， 已有大量研究證實其在多種自身免疫性疾病中通過分泌IL-17 發揮促炎生物學效應。 Th17 可通過IL-17 誘導自身反應性生發中心形成以及自身抗體的分泌[10]。 因此，Th17 可能也參與了自身抗體分泌過量的HT 發生過程，在小鼠模型中，Th17 相關免疫反應確實對于碘誘導的自身免疫性甲狀腺炎的發展必不可少[11]。 在HT 患者中，本研究亦發現了IL-17 細胞因子相較對照組顯著上調，這與J Gerenova 等[12]的研究結果一致。 這些結果進一步提示Th17 細胞及相關細胞因子參與了HT 的發展過程，但具體調控機制有待深入研究。 此外，Treg 細胞作為重要的免疫負調控CD4+T細胞亞群，在自身免疫性疾病中已經得以證實，其可通過分泌IL-10 效應細胞因子維持自身耐受性并阻止自身免疫反應[13]。 在HT 中，當去除Treg 細胞后，自身免疫性甲狀腺炎耐受的NOD.H-2h4 小鼠會變得對自身免疫甲狀腺炎極為敏感[14]。而本研究利用HT 患者發現IL-10 顯著下降，這些研究表明Treg 細胞及其效應細胞因子在HT 發生發展中可能扮演保護作用。 Th17 和Treg 構成了HT 免疫失衡中重要的作用軸， 而這一平衡軸紊亂的調控機理并不清楚。

表3 HT 患者血 清HMGB1 和RAGE 與TSH、TPOAb、TgAb、IL-17、IL-10 的相關性

HMGB1 是一類免疫調控分子，其可在炎癥反應刺激時被單核細胞分泌而作為損傷相關模式識別受體分子[15]。HMGB1 受體為RAGE，既往研究證實兩者結合可在免疫和炎癥過程中抑制Treg 細胞反應而促進Th17 細胞反應[16]。 Li J.等在乙肝患者中發現高表達的HMGB1 可扭轉Th17/Treg 平衡，導致Th17 占據主導地位，而Treg 被削弱，進而加速肝臟損傷和炎癥反應[17]。 而關于其是否與HT 患者中異常的Th17/Treg 存在關聯， 目前并不清楚。在本研究中，我們發現HMGB1 和RAGE 在HT 患者中均顯著上調， 提示其可能作為HT 生物標志物， 這在未來研究中有必要進步一擴大樣本量進行驗證。 進一步相關性分析發現，HT 患者血清HMGB1 與血清IL-17 和IL-10 均存在顯著相關性，這在一定程度上提示HMGB1 可能參與了異常Th17 和Treg 平衡紊亂。 而這有必要在將來研究中在體外細胞實驗和動物模型中利用基因敲除進一步證實。Jia-wang Ding 等[18]在動脈粥樣硬化患者中發現HMGB1 與Th17 顯著正相關，而與Treg 細胞呈顯著負相關關系，這與本研究結果類似。 此外，本研究還評價了受體RAGE 與IL-17 和IL-10 的關系， 結果發現RAGE 僅與IL-10 呈顯著負相關性，這可能是因為HMGB1 發揮免疫負調控效應可能并不完全是通過RAGE 受體實現， 如既往研究發現HMGB1 除了與RAGE 受體作用外還可以與TLR-2 和TLR-4 受體結合通過多通路參與巨噬細胞等活化過程，進而促進下游信號激活，誘導包括促炎細胞因子的分泌和T 細胞的活化[19]。這也部分解釋了RAGE 僅與IL-10 相關，而與IL-17 不相關的結果。 本研究還存在一定的不足之處，主要為：⑴未測定外周血Th17 和Treg 細胞頻率，而僅測定效應細胞因子水平； ⑵樣本量相對較小， 若驗證HMGB1 生物標志物作用需要多中心大樣本量。

總之，本研究初步發現HT 患者存在異常上調的HMGB1 和RAGE，而其又與IL-17 和IL-10 存在顯著相關性， 提示HMGB1 可能通過調控Th17/Treg 進而參與HT 的發生發展過程。