黃芪總黃酮通過抗炎抗氧化作用減輕大鼠肝纖維化的實驗研究*

諶衛龍，李衛明，張守華，雷俊，涂小飛，曾俊權

（江西省兒童醫院，1.普外科；2.檢驗科，南昌330006；3.井岡山大學醫學部，吉安343009）

黃芪為補虛良藥，廣泛地應用于臨床[1]，但同時由于中藥藥物成分復雜， 在臨床應用中引起一些問題，比如對腎功能損害、過敏發應等。 因此，利用現代中藥藥物提純技術尋找出并利用現代實驗技術驗證中藥的有效成分是改善中藥不良反應的主要方法。黃芪總黃酮（TFA）是從中藥黃芪中分離的主要活性成分，在多種方劑中均有應用，既往文獻報道其具有抗氧化、保肝、抗細胞凋亡、抗腫瘤、免疫調節和抗病毒等多種生物學作用[2-4]。 也有報道黃芪能改善紅細胞變形能力， 降低纖維蛋白原及全血比黏度，抑制血小板黏附[5,6]。 本實驗進一步驗證黃芪總黃酮改善肝纖維化的效果及機制。 據此，本實驗通過構建大鼠肝纖維化模型，初步探討黃芪的主要有效成分黃芪總黃酮 （total flavonoids of astragalus，TFA） 對改善肝纖維化效果和機制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 32 只SPF 級SD 大鼠， 重量180-220g，由南昌大學動物實驗中心提供，所有動物普通飲食，自由飲水。

1.1.2 試劑儀器黃芪總黃酮購于南京春秋生物工程有限公司；四氯化碳購于上海試劑三廠；RNA 提取試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；RNA 逆轉錄、熒光定量PCR 試劑盒購自全式金生物有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH） 測試盒購自南京建成生物工程研究所；NF-κB、TNF-α、FXR 多克隆一抗和多克隆二抗購自Abcam 公司； 引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥 大鼠隨機分為4 組：正常組（Normal）、模型組（Model）、TFA 高劑量 組、TFA低劑量組，每組8 只。用CCl4誘導大鼠形成肝纖維化模型。 除正常組，其余三組給予40% CCL4橄欖油混合液皮下注射，每周2 次，共8 周。 第5 周開始，TFA 低劑量組和TFA 高劑量組給15mg/kg 和30mg/kg 的TFA 灌胃，1 次/日，治療4 周，模型組予等量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 標本采集8 周后，采腹腔靜脈血，分離血清，用于AST、ALT、ALB 等肝功能檢測；取部分肝葉用4% 甲醛溶液固定做常規組織病理學觀察，另一部分用于做Western blot、定量PCR、MDA、SOD、GSH等檢測。

1.2.3 肝功能等指標檢測 應用全自動生化儀器檢測血清AST、ALT、ALB 等含量。 各組肝組織勻漿，根據試劑盒說明書檢測MDA、SOD、GSH 等氧化水平。

1.2.4 Realtime PCR 法檢測肝組織中相關炎癥因子的表達 根據試劑盒提取肝組織總RNA， 逆轉錄合成cDNA，以cDNA 為模板，按照說明書進行擴增，檢測NF-κB、TNF-α、FXR 的mRNA，以βactin 作為內參。 引物序列如下：β-actin 上游：5’-TTCAACACCCCAGCCATGT -3’， 下 游 ：5’ -GCATACAGGGACAACACAGCC-3’；NF-κB 上 游5’-TCTGTTTCCCCTCATCTTTCCC-3’， 下游5’-GTCTTAGTGGTTCTGTGCTTCTC-3’；TNF-α 上 游5’-CGCTCTTCTGTCTACTGAACTTC-3’，下游5’-CTGCTTGGTGGTTTGCTACG-3’；FXR 上 游5’-TGGACTCATACAGCAAAC AGAGA-3’， 下游5’-GTCTGAAACCCTGGAAGTCTTTT-3’

1.2.5 Western blot 分析 取各組肝組織用RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。 蛋白樣品經凝膠電泳分離， 電轉至PVDF 膜，5%BSA 封閉，加入TNF-α （1:1000）、FXR （1:1000）、NF-κB（1:2000）多克隆一抗及β-actin（1:2000）一抗，4℃孵育過夜。Quantity One 4.0 軟件進行條帶灰度分析。β-actin 作為內參。

1.3 統計學數據分析 采用SPSS 23.0 軟件進行數據結果分析。 數據采用(±s)表示，組間或組內采用ANOVA-One 分析, 方差不齊時采用Tamhane’T2分析。

2 結果

2.1 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝功能的影響 與正常組比較， 皮下注射CCl48 周能造成明顯的肝纖維化及肝損傷， 模型組與正常組相比AST、ALT明顯升高，ALB 下降（P＜0.05）；TFA 可以明顯減輕CCL4引起的肝功能異常（P＜0.05），較模型組相比AST、ALT 降低（P＜0.05），ALB 升高（P＜0.05），并且TFA 高劑量組較低劑量組有更好的護肝降酶作用（表1）。

表1 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝功能的影響(±s)

表1 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝功能的影響(±s)

#P＜0.05 vs Normal, *P＜0.05 vs Model,& P＜0.05 vs Low TFA

分組 AST(U/L) ALT(U/L) ALB(g/L)Normal（8 例）Model（8 例）Low TFA（8 例）High TFA（8 例）35.13±5.38#*&23.63±3.81#&28.25±3.20#*29.13±4.79#*111.38±14.30*&559.38±66.26#&415.75±58.95#*278.88±62.47#*&45.75±8.68*&430.75±41.35#&339.38±65.42#*255.38±44.47#*&

2.2 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟病理改變及膠原纖維的影響 HE 染色可見正常組大鼠肝細胞大小正常，形態規則，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結構完整（Fig1 A），模型組大鼠肝組織HE 染色可見肝細胞壞死、脂肪變性，大量炎癥細胞浸潤，肝索排列紊亂，肝組織匯管區間、匯管區與中央靜脈間大量纖維組織形成并可見假小葉形成（Fig1B）。 經TFA 治療4 周后，低劑量組仍可見肝纖維化(箭頭所示纖維化改變)，肝小葉結構較完整， 可見明顯的細胞脂肪變以及炎性細胞浸潤（Fig1C），高劑量組顯示肝纖維化程度減輕，少量的細胞脂肪變以及炎性細胞浸潤（Fig1D）。

圖1 小鼠肝臟HE 染色圖

2.3 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關炎癥因子及FXR mRNA 表達的影響 與正常組相比， 模型組NFκB、TNF-α mRNA 水平明顯升高 （P＜0.05），FXR mRNA 水平降低（P＜0.05）。 經過TFA 治療4周后， 與模型組對比， 均明顯抑制肝組織中NFκB、TNF-α mRNA 表達， 上調FXR mRNA 的表達（Fig2）。 其中，高劑量組更為明顯，說明高劑量組TFA 有較好的抗炎效果。

2.4 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關炎癥因子及FXR 蛋白表達的影響 與正常組比較， 模型組NF-κB、TNF-α 蛋白表達升高（P＜0.05），FXR 蛋白水平降低（P＜0.05）。 經過TFA 治療4 周后，與模型組對比，均明顯抑制肝組織中NF-κB、TNF-α 蛋白表達，上調FXR 蛋白的表達（Fig3）。 其中，高劑量組更為明顯， 結果與mRNA 水平一致， 說明TFA有較好的抗炎效果。

2.5 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟過氧化相關指標的影響 與正常組相比，模型組MDA 升高（P＜0.05），GSH、SOD 水平降低（P＜0.05）。 經過TFA 治療4 周后，與模型組對比，明顯下調肝組織中MDA 水平，上調GSH、SOD（P＜0.05）（Fig4）。 其中，高劑量組更為明顯， 說明TFA 有較好的抗過氧化損傷作用。

圖2 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關炎癥因子及FXR mRNA 表達的影響

圖3 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟相關炎癥因子及FXR 蛋白表達的影響

3 討論

肝纖維化是以各種因素如乙肝、毒素和藥物、寄生蟲、酒精、肝淤血、遺傳代謝性疾病等導致肝臟慢性炎癥，刺激纖維結締組織異常增生，膠原蛋白、纖連蛋白等細胞外基質（ECM）的增生與降解失衡，最終過度沉積在肝臟組織，是多種慢性肝臟疾病中晚期共有的病理生理過程[7-9]。 傅纓等的研究顯示， 發酵蟲草菌粉可通過上調基質金屬蛋白酶1（MMP-1）及降低金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）表達，發揮抗肝纖維化作用[10]。 肝纖維化在早期階段是可以逆轉的， 但若致病因素持續存在， 長時間的肝臟炎癥、 肝纖維化可進展為肝硬化，此階段病變難以逆轉，部分可導致肝細胞癌。四氯化碳（CCl4）是一種十分經典的急慢性肝損傷造模毒物，廣泛應用于肝臟疾病等基礎研究[11]。 本實驗結合既往前期的造模經驗， 采用CCl4皮下注射方法，8 周后成功構建大鼠肝纖維化模型[12]。 模型大鼠可見肝臟纖維化改變， 肝細胞可見脂肪變性以及壞死，這與人體肝纖維化病理改變類似。 本實驗在造模第四周即開始給予TFA 治療， 與第一天即開始給藥治療相比， 此時間點給藥更符合人類患病后治療過程。

已有眾多研究證明， 許多慢性疾病包括腫瘤以及心血管、內分泌、消化系統等疾病均與人體內蓄積過多的氧自由基有一定關系[13-15]。 機體是通過酶和抗氧化物來清除有害自由基的， 比如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶等。 當機體受到有害物質等攻擊時， 大量的氧和自由基的釋放，搶奪其他分子包括蛋白質、脂類、糖類等以及脫氧核糖核酸上的電子， 在此過程中將產生更多的自由基，引發鏈式反應，當機體天然的防御機制不能根除這些自由基時，導致細胞損傷，細胞膜被侵蝕，細胞完整性喪失等。 戴穎等的研究顯示熊果酸可通過阻斷氧化應激和脂質過氧化過程,增加細胞ECM 的降解,并減少ECM 的沉積等機制，治療大鼠肝纖維化[16]。

TFA 在清除自由基作用方面已有相關報道，并且在心肌、肝臟、肺等組織器官均可經抗氧化而發揮藥理作用[17,18]。 有研究報道TFA 可增加急性心肌梗死模型大鼠心肌細胞鈣內流及改善心臟血流動力學, 并且可有效的維護心肌細胞膜的穩定性[19]。 在肺纖維化方面，徐昌君等通過博萊霉素構建肺纖維化小鼠，后給予黃芪多糖、黃芪皂苷以及黃芪黃酮, 發現黃芪黃酮改善肺纖維化效果最為理想,并發現TFA 可通過抑制TGF-β 和TNF-α 表達而抑制肺纖維化的進程[20]。 麥靜愔等發現TFA 可下調大鼠脂肪酸轉位酶和環氧化酶-2 的表達，對肝組織的膠原增生有明顯的抑制作用而改善肝纖維化進程[21]。 本實驗利用CCl4構建肝纖維化模型后給予不同劑量的TFA， 亦發現可以改善肝纖維化大鼠肝功能，下調TNF-α 等炎性蛋白指標，并且高劑量組TFA 更為明顯。 進一步檢測SOD、MDA等指標發現，TFA 亦可明顯改善肝臟過氧化損傷。

法尼酯衍生物X 受體( FXR)是一種膽汁酸受體,屬于核受體超家族，在消化、泌尿等系統的組織器官均高表達。 在消化系統中廣泛參與膽汁酸、膽固醇代謝以及糖代謝[22,23]。 當配體與FXR 結合后,FXR 的空間結構發生改變并被活化， 活化的FXR與視黃醇類X 受體α （retinoid X receptor α，RX Rα）形成異二聚體,調節靶基因的轉錄。 近來研究更發現FXR 具有顯著的抗腫瘤功能, 調控細胞增殖和凋亡等過程[24,25]。陳科全發現FXR 激動劑GW 4064 能導致HSC-T6 細胞株TIMP-1 及TIMP-2表達減少，減弱對MMP 的降解，最終增強MMP 降解ECM 的能力，從而緩解肝纖維化[26]。 激動FXR能抑制細胞凋亡，并阻止肝纖維化進程[27]，本實驗中亦發現TFA 能上調肝臟FXR 的表達，這可能解釋了TFA 改善肝纖維化的作用機制。 綜上所述，TFA 能改善肝纖維化的進程， 其機制可能與改善過氧化損傷、上調FXR 的表達有關，具有很好的開發和應用前途。

圖4 TFA 對大鼠肝纖維化模型肝臟過氧化相關指標的影響