茯苓對去卵巢大鼠認知行為的影響*

鄭麗麗，張玲，黃荳，羅琳，李偉，馮旭輝

（江西省婦幼保健院藥劑科，南昌330006）

雌激素水平參與了學習、 記憶等腦功能的調節。 女性絕經后雌激素的缺乏可引起記憶力和認知功能的衰減，增加了阿爾茨海默病（AD）的發病風險。 中藥在改善認知、改善學習記憶障礙方面的研究受到了越來越多的關注[2]。 茯苓（poria cocos）為多孔菌科真菌茯苓[poria cocos (schw)wolf]的干燥菌核。 目前對于含有茯苓的復合物改善學習記憶方面作用的研究逐漸增多， 但茯苓單藥的作用效果及可能作用機制卻鮮有報道。 因此本研究通過去卵巢大鼠建立低雌激素記憶障礙模型 （戊酸雌二醇組為陽性對照組），觀察茯苓對去卵巢大鼠在Morris 水迷宮中空間學習記憶能力的影響，并觀察各組動物腦中與學習記憶功能密切相關的BDNF、TrkB 蛋白表達水平的變化， 探討茯苓改善絕經后婦女認知功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6-8 個月齡SPF 級雌性SD 大鼠，體質量180-200g， 由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2014-0001， 于江西省精神病院實驗動物中心飼養。

1.2 藥物及試劑 茯苓 （中國食品藥品檢定研究院，批號：121117-201910）；戊酸雌二醇片（拜耳藥業，批號：455A）；0.9%氯化鈉溶液（江西通達藥業，批 號：1903143301）；BDNF、pTrkB、TrkB、actin 抗體：購自Santa cruz 公司。

1.3 模型制作 大鼠禁食24 h， 禁水8 h， 用10%水合氯醛（3ml·kg-1）進行麻醉，打開腹腔對雙側卵巢進行切除。假手術組僅切除卵巢周邊部分脂肪組織，縫合腹壁，禁食24 h。

1.4 分組與給藥 將60 只實驗大鼠隨機分為為模型組、假手術組、戊酸雌二醇（0.8mg/kg）、茯苓低、中、高 劑 量 組（0.3g/kg、0.6g/kg、1.2g/kg），每 組10只。 模型組和假手術組灌胃0.9%氯化鈉溶液10 ml·/kg，每日給藥1 次，連續5 周。

1.5 Morris 水迷宮實驗 水溫為19℃-20℃，水池包括I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個象限。 定位航行實驗：將水下平臺置于某一象限（在訓練的5d 中位置固定不變）。大鼠分別從4 個不同象限面對池壁放入水中，找到平臺后，記錄逃避潛伏期，如果大鼠在60s 內未找到平臺，逃避潛伏期標記為60s。 5d 的定位航行實驗后撤掉水下平臺進行空間探索實驗， 記錄大鼠60s 內穿越原平臺區域的次數。

1.6 樣本收集 大鼠麻醉后， 沿中線剪開頭皮，暴露并剪開頭蓋骨，掀開腦膜，將腦剝離，沿大腦矢狀線分別往左右兩邊分開大腦皮層，分離出海馬，收集海馬，-80℃保存備用。

1.7 Western blotting 法檢測BDNF 和TrkB 蛋白及其磷酸化表達水平 精密稱取海馬組織，研磨并用RIPA 裂解液裂解組織，離心取上清液。 考馬斯亮藍法測定蛋白含量。 取樣品加入上樣緩沖液混合，煮沸5min，電泳，轉膜，用5%脫脂牛奶封閉1h。 一抗4℃孵育過夜， 上二抗室溫孵育1h，TBST 漂洗15min×3 次。 電致化學發光顯色，定影，分析灰度值。

1.8 統計學分析 采用SPSS 21．0 軟件進行統計學分析，所有數據均采用(±s)表示，采用單因素方差分析，組間均值進行t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水迷宮法觀察茯苓對大鼠學習、記憶功能的影響 與模型組相比，假手術組、茯苓中、高劑量組和戊酸雌二醇組均能明顯減少訓練第6 天大鼠第1次經過平臺的時間（逃避潛伏期），差異具有統計學意義（P＜0.05）。 空間探索實驗結果顯示，與模型組相比，假手術組、茯苓中、高劑量組和戊酸雌二醇組跨越平臺次數明顯增加， 差異具有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

2.2 western-blot 技術檢測各組大鼠海馬組織內蛋白水平變化 與假手術組相比，模型組海馬組織中BDNF 蛋白及TrkB 蛋白的磷酸化表達水平明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），但對TrkB 蛋白總蛋白的表達水平無明顯影響， 差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，茯苓中、高劑量組和戊酸雌二醇組均能明顯增加BDNF 蛋白及TrkB 蛋白的磷酸化的表達水平，差異具有統計學意義（P＜0.05），但對TrkB 蛋白總蛋白的表達水平無明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見圖1。

表1 各組大鼠水迷宮測試結果（n=10±s）

與模型組比較：*1P＜0.05

測試指標 逃逸潛伏期（s） 經過平臺次數（次）假手術組模型組陽性對照組茯苓治療低劑量中劑量高劑量6.12±1.65*1 2.17±0.87 7.24±3.22*1 2.98±1.67 7.11±3.49*1 7.89±3.66*1 11.35±5.87*1 25.36±10.28 13.66±8.94*1 20.53±6.17 14.11±6.52*1 12.68±6.08*1

圖1 6 組大鼠蛋白BDNF、TrkB、pTrkB 表達（n=10±s）

3 討論

茯苓是一種常用中藥， 主要成分為三萜類和多糖類，具有增強免疫功能、利尿、抗炎、保肝、抗衰老等藥理作用[3]。 茯苓改善學習記憶方面的研究近些年逐漸增多。 含茯苓的中藥方劑不忘散可以明顯改善絕經模型大鼠的認知能力[4]。 茯苓復合物如遠志茯苓醇提物能改善學習記憶障礙模型小鼠的學習記憶能力[5]。 人參-茯苓藥可以多途徑、多通路治療老年性癡呆[6]。 據中草藥相關文獻分析：茯苓常用于老年性癡呆及其他原因造成的學習記憶能力的提高[2,7]。目前包含茯苓的復方制劑如安坤顆粒、 坤泰膠囊等中成藥已經廣泛用于絕經前后諸癥。Morris 水迷宮試驗主要用于評價藥物對空間學習記憶能力獲得的影響。 本實驗研究證明： 茯苓能明顯縮短Morris 水迷宮試驗中去卵巢大鼠逃避潛伏期，增加跨越平臺次數。 因此茯苓對去卵巢大鼠模型的學習和記憶能力具有促進作用。

腦源性神經營養因子（brain—derived neurotrophic factor，BDNF）是人體內含量最為豐富的神經營養因子，主要分布在海馬和大腦皮質。 其中與TrkB 受體結合是BDNF 最主要的信號通路，BDNF 與TrkB 受體結合后， 通過激活下游的信號轉導通路在神經重塑、 理解和記憶方面扮演重要角色[8]。BDNF 與TrkB 通過參與神經細胞的生長發育及調節突觸可塑性等方面， 可調節大腦海馬區的學習記憶功能[9]。 本實驗研究證明：模型組海馬組織中BDNF 蛋白及TrkB 蛋白磷酸化的表達水平明顯降低， 而茯苓可以上調BDNF 蛋白及TrkB蛋白磷酸化的表達水平。

綜上所述，茯苓能夠通過激活BDNF／TrkB 信號通路來促進去卵巢模型鼠學習、記憶能力。 茯苓作為一種有效的益智中藥單方制劑，對于AD 患者尤其是絕經后婦女記憶障礙的患者， 具有重要的臨床治療意義。