腦膜癌病患者的腦脊液細胞學與免疫組化診斷價值分析

高標 ，李相磊 ，馬春燕 ，黃利娜 ，劉妍 ，高園林

（開封市中心醫院1.檢驗科；2.神經內科，河南 開封 475001）

腦膜癌?。∕eningeal carcinomatosis，MC）又稱腦膜轉移癌或癌性腦膜炎，在實體腫瘤患者中患病率約為4%～15%，為中樞神經系統轉移瘤特殊分布類型之一，是腫瘤細胞通過血行轉移或腦脊液散播浸潤腦膜和脊髓膜，隨血管周圍間隙侵入大腦皮質而發生一種惡性病變，臨床表現為腦、脊髓受損和腦神經癥狀， 是惡性腫瘤致死的重要原因之一[1，2]。MC 起病隱匿，轉移形式較為特殊，臨床表現復雜多樣，且一般顱內無實質性病變，影像學檢查缺乏特異性，臨床診斷較為困難，易發生漏診和誤診，影響患者預后。本研究選取55 例MC 患者，以所有患者腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）為檢測基礎，分析CSF 細胞學在MC 中應用價值，并采用免疫細胞化學方法檢測上皮膜抗原（EMA）、細胞角蛋白20（CK20）、癌胚抗原（CEA）、新天冬氨酸蛋白酶 A（Napsin A）、甲狀腺轉錄因子（TTF-1）、細胞角蛋白7（CK7）6 種腫瘤標記物在 CSF 中定位表達，為尋找MC 原發灶提供依據，報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取 2013 年 8 月-2018 年 11 月我院收治的55 例MC 患者，均根據癥狀體征、影像學檢查、CSF 細胞學檢查證實，并簽署知情同意書，排除預估生存期＜6 個月者、休克者、可疑顱內占位病變、腦疝、凝血功能障礙患者，其中男26 例，女29例，年齡 38～78 歲，平均 50.18±6.09 歲，發病至確診時間 7～129d， 平均 55.79±27.90d。 本研究符合《世界醫學會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 羅氏COBAS C702 全自動生化分析儀購置于美國羅氏公司；FMU-6 細胞涂片離心沉淀儀購置于西安安美生物科技有限公司； 細胞圖像分析系統及奧林巴斯CX31 型光學顯微鏡均購置于上海北昂醫療技術有限公司。

1.2.2 主要試劑 瑞吉氏染液購置于珠海索貝生物技術有限公司；鼠抗人EMA 單克隆抗體；鼠抗人CK20 單克隆抗體；鼠抗人CEA 單克隆抗體；鼠抗人Napsin A 單克隆抗體； 鼠抗人TTF-1 單克隆抗體（8G7G3/1）；鼠抗人CK7 單克隆抗體均購于北京中杉科技有限公司。

1.2.3 CSF 常規細胞學檢查 腰椎穿刺第3 管進行細胞學檢查，留取5mL 腦脊液，采用改良牛鮑氏計數盤進行白細胞計數，應用玻片離心沉淀法，收集CSF 細胞玻片 7 張。

1.2.4 CSF 生化檢查 腰椎穿刺第2 管， 進行蛋白含量、葡萄糖含量、氯化物水平檢測。

1.2.5 CSF 細胞學、 免疫組化染色檢查 標本均嚴格按SOP 文件操作。

1.2.6 結果判定 ⑴瑞吉氏染色陽性標準: 發現腫瘤細胞。 細胞形態學特點：細胞大小不一，細胞體大，胞核常偏向一側，胞漿著色變深，富含空泡，多為藍色，黑色素瘤細胞漿內顯示黑色素顆粒沉著，部分患者可顯示絲狀分裂，核漿比例增大，核仁清晰，核染色質變粗，染色加深，核異型明顯，雙核或多核，腫瘤細胞較多患者細胞聚集為團簇狀，見圖1、2。⑵TTF-1 陽性標準：細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性，當細胞質存在表達時，細胞核表達強度高于細胞質方可評定為陽性； ⑶EMA、CK20、CEA、Napsin A、CK7 陽性標準：未分化或低分化腺癌EMA 主要分布于細胞漿中， 高分化腺癌EMA 呈膜型分布，細胞膜、胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，彌漫性非顆粒狀細胞質染色判為陰性，CK20、CEA、Napsin A、CK7 胞漿出現棕黃色顆粒為陽性。

圖1

圖2

1.3 觀察指標 ⑴瑞吉氏染色結果。 ⑵臨床癥狀、腦脊液常規與生化檢查、腫瘤原發病灶分布情況。⑶EMA、CEA、CK7 診斷 MC 靈敏度、 陽性預測值。⑷EMA、CK20、CEA、Napsin A、TTF-1、CK7 在原發灶中陽性表達率。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件處理數據，計量資料以（±s）表示、t 檢驗，計數資料用 n（%） 表示、χ2檢驗。 P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 瑞吉氏染色結果 55 例MC 患者瑞吉氏染色結果均為陽性，其中 27 例（49.09%，27/55）首次腰穿發現腫瘤細胞，28 例（50.91%，28/55）經反復腰穿發現。

2.2 臨床癥狀、CSF 常規與生化檢查、 腫瘤原發灶分布情況 MC 首發癥狀以頭痛（83.64%）、惡心/嘔吐（78.18%）、精神改變（78.18%）、腦膜刺激征（63.6 4%）、意識不清（47.27%）、聽神經受累（32.73%）為主， WBC、蛋白含量、葡萄糖含量、氯化物水平均伴有不同程度異常，腫瘤原發灶為肺癌（34.55%）、乳腺癌（25.45%）、胃癌（21.82%）、卵巢癌（18.18%），見表1。

表1 臨床癥狀、CSF 常規與生化檢查、腫瘤原發灶分布情況(n=55)

2.3 診斷 MC 情況 55 例 MC 患者中，EMA 陽性45 例，CEA 陽性 29 例，CK7 陽性 33 例，EMA+CEA陽性 47 例，EMA+CK7 陽性 50 例，EMA+CEA+CK7陽性 53 例 。 EMA、CEA、CK7、EMA+CEA、EMA+CK7、EMA+CEA+CK7 檢測陽性預測值均為100%，靈敏度比較差異顯著（P＜0.05）；EMA+CEA+CK7 檢測靈敏度高于任何單一或兩兩聯合靈敏度 （P＜0.05）。 見表2。

表2 各指標診斷靈敏度與陽性預測值（n=55）

2.4 各指標在原發灶中陽性表達率 EMA 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率比較無顯著差異（P＞0.05）；CK7 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率比較差異顯著 （P＜0.05）；CK20 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率均為0，低于胃癌中陽性表達率 25.00%（P＜0.05）；CEA 在乳腺癌中陽性表達率為0，低于胃癌、卵巢癌、肺癌中陽性表達率 66.67%、100.00%、52.63%（P＜0.05）；Napsin A 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 84.21%（P＜0.05）；TTF-1 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 73.68%（P＜0.05）。 見表3。

3 討論

MC 好發于中老年人群，病情進展較快，早期診斷對改善患者預后具有積極意義。 MC 臨床癥狀表現出多樣化，本研究中首發癥狀以頭痛、惡心/嘔吐、精神改變、腦膜刺激征、意識不清、聽神經受累為主，其中頭痛占83.64%，患者多為陣發性頭痛，較為劇烈， 以轉移性疼痛或全頭部脹痛為表現形式，隨著疾病進展，頭痛時間逐漸延長，出現胃腸道反應，嚴重者可伴有噴射性嘔吐，63.64%患者早期即出現腦膜刺激征，其原因與癌細胞轉移至腦膜后導致局部炎性反應，誘發顱內壓變化，影響腦脊液循環有關。 當癌細胞隨血管間隙進入腦實質，可出現精神變化、意識障礙，當癌細胞侵犯脊神經和腦神經，可導致聽神經受累、視力障礙等[3，4]。但以上特征表現在較多疾病中均可呈現，缺乏特異性，單一依賴臨床癥狀無法對MC 進行診斷。

以往研究證實，MC 患者常表現為壓力增高，白細胞計數輕度增高或正常，蛋白含量增加，葡萄糖與氯化物水平降低[5-7]。 本研究CSF 常規檢查與生化檢查中，72.73% MC 患者壓力增高，WBC 水平均低于100×106/L，70.91%患者蛋白含量低于0.45 g/L，72.73%患者葡萄糖含量低于 2.5mmoL/L，52.73%患者氯化物水平低于118mmoL/L，與以往研究基本相符，但這些特征易與腦膜炎混淆，因此需進行CSF 細胞學檢查明確診斷。 米芳等[8]研究指出，CSF 癌細胞第一次腰穿后陽性率為45%左右，第二次腰穿陽性率為80%左右，3 次腰穿后陽性率在90%以上。 本研究55 例患者瑞吉氏染色結果均為陽性，其中49.09%首次腰穿發現腫瘤細胞，其余患者經反復腰穿發現， 提示反復腰穿進行CSF 細胞學檢查有助于提高診斷陽性率。此外MC 病理類型以腺癌、鱗癌為主，文獻報道指出，MC 原發灶來源日本主要為胃癌，歐美主要為乳腺癌，國內以肺癌為首[9，10]。 本研究結果顯示腫瘤原發病灶肺癌占34.55%，乳腺癌占25.45%、胃癌占21.82%、卵巢癌占18.18%，與以上報道相符。

目前CSF 細胞學檢查被認為是診斷疾病金標準，但腫瘤細胞不一定出現在CSF 中，故首次腰穿陽性率較低。 既往資料顯示，14.3% MC 患者需進行反復多次腰穿才可發現癌細胞[11]。分析其原因可能為：⑴疾病早期癌細胞脫落至CSF 數量較少；⑵MC 以軟腦膜受累較為常見，腰穿留取標本相距軟腦膜較遠，一次腰穿不能反應疾病狀態；⑶CSF 流暢不通，腫瘤細胞分布不均勻，具有一定隨機性。因此對疑似MC 患者進行反復多次腰穿對疾病早期診斷是必要的。 常規細胞學檢查以細胞形態學特點為診斷基礎，具有簡單直觀特點，但癌細胞多附于腦膜脊膜或漂浮于腦脊液， 增生繁殖無束縛性，形態特征發生了變化，部分癌細胞異型性不明顯，較難與退化細胞、反應性細胞區分，且MC 原發腫瘤類型較多，依靠單一CSF 細胞形態難以明確原發病灶[12]。

表3 各指標在原發灶中陽性表達率（n=55）

EMA 存在于各種類型正常上皮中， 在上皮分化腫瘤、某些惡性淋巴瘤中亦有表達；CEA 廣泛存在于各種上皮樣腫瘤；CK7 表達于上皮源性原發與轉移腫瘤細胞、正常上皮中，因為其細胞轉化過程中保持免疫學特性和亞微結構，故可用于鑒別癌細胞來源[13]； CK20 被認為是膀胱移行上皮腫瘤和胃腸道腫瘤較為特異的標志[14]；Napsin A 特異性表達于正常腎和肺中，腫瘤組織中，其多表達于肺癌[15]；TTF-1 主要表達于細支氣管上皮細胞、 肺泡細胞、甲狀腺細胞等[16]。 本研究嘗試采用免疫細胞化學方法檢測6 種腫瘤標記物在CSF 中定位表達，結果發現 EMA、CEA、CK7、EMA+CEA、EMA+CK7、EMA+CEA+CK7 診斷MC 陽性預測值均為100%，EMA+CEA+CK7 診斷MC 靈敏度高于任何單一或兩兩聯合靈敏度（P＜0.05），提示 EMA+CEA+CK7 聯合檢測可對MC 進行輔助性診斷。 而CK20 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌中陽性表達率均為0，低于胃癌中陽性表達率 25.00%（P＜0.05），說明 CK20 陽性提示MC 原發灶為胃癌可能性較大；CEA 在乳腺癌中陽性表達率為0，低于胃癌、卵巢癌、肺癌中陽性表達率 66.67%、100.00%、52.63%（P＜0.05）， 說明 CEA陰性提示原發灶為乳腺癌可能性較??；Napsin A在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 84.21%（P＜0.05），說明 Napsin A陽性提示原發灶為肺癌可能性較大；TTF-1 在胃癌、卵巢癌、乳腺癌中陽性表達率均為0，低于肺癌中陽性表達率 73.68%（P＜0.05）， 說明 TTF-1 陽性提示原發灶為肺癌可能性較大。

綜上所述，MC 臨床表現缺乏特異性，對于CSF常規檢查與生化檢查異常中樞神經系統病變患者應開展CSF 細胞學檢查，EMA+CEA+CK7 可用于MC 輔助性診斷，CK20、CEA、Napsin A、TTF-1 有助于MC 原發灶鑒別。 本研究不足之處是因CSF標本留取量較少，未對6 種腫瘤標記物進行各種組合免疫組化，取得成果仍需大樣本量實驗驗證。