水酶法制取高芝麻素酚芝麻油的工藝優(yōu)化

龍紅杏，史海明，姜元榮，李保國(guó)*

（1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093；2.豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海200137）

芝麻油因其風(fēng)味獨(dú)特、不飽和脂肪酸含量較高、富含維生素E、植物甾醇、芝麻素、芝麻酚等功能性成分，深受大眾喜愛(ài)，是一種公認(rèn)的健康油脂[1]。木脂素是一類(lèi)具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化作用的天然化合物[2]，以多種形式廣泛分布于植物中，尤其是在芝麻和亞麻籽中含量較高。研究表明，芝麻油具有突出的氧化穩(wěn)定性，與其含有的芝麻木脂素密切相關(guān)[3]。芝麻中主要的木脂素包括油溶性的芝麻素和芝麻林素以及以糖苷形式存在的水溶性芝麻素酚糖苷[4]。然而由于芝麻素和芝麻林素?zé)o酚羥基，本身抗氧化活性并不高，所以芝麻油的抗氧化活性主要來(lái)源于木脂素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，如焙炒后產(chǎn)生的芝麻酚、酶解或精煉后產(chǎn)生的芝麻素酚等[5]。在芝麻木脂素中，芝麻素酚和芝麻酚抗氧化活性最強(qiáng)[6]，而相較于芝麻酚，芝麻素酚的熱穩(wěn)定性更好[7]，因此提高芝麻油中芝麻素酚的含量，有利于提升芝麻油的品質(zhì)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于芝麻木脂素的研究主要集中在芝麻木脂素定量檢測(cè)方法的建立[8-9]、芝麻素酚糖苷的分離純化[10-11]、酶法制備芝麻素酚[12]以及芝麻油品質(zhì)的分析[13]等。以提高芝麻油中木脂素含量為目的，制備高芝麻素酚芝麻油鮮有報(bào)道。芝麻油的提取方式多樣，其中水酶法條件溫和、能耗低、制取的毛油品質(zhì)好，蛋白質(zhì)資源可再利用，無(wú)須深度精煉即可食用，且不存在溶劑殘留等而備受關(guān)注[14]。但現(xiàn)有水酶法的文獻(xiàn)大多關(guān)注于油料中蛋白質(zhì)的回收利用[15-16]、提高出油率[17-18]等，對(duì)油品品質(zhì)的強(qiáng)化研究很少。作者以提高芝麻油中芝麻素酚含量為目的，通過(guò)水酶法將水溶性芝麻素酚糖苷轉(zhuǎn)化為油溶性的芝麻素酚，并對(duì)影響酶解的因素進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化，制取高芝麻素酚芝麻油。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

埃塞黃白芝麻：超市購(gòu)買(mǎi)，經(jīng)M-100石磨研磨成 醬 備 用；Rapidase sensation、Rapidase fiber、Bakezyme wholegain、Brewers compass酶：DSM公司產(chǎn)品；Aromase H2、Cellulase A酶：天野酶制劑（江蘇）有限公司上海分公司產(chǎn)品；鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、無(wú)水甲醇、異丙醇、酚酞（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無(wú)水甲醇（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

M-100石磨：現(xiàn)林石磨農(nóng)副產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；安捷倫1260高效液相色譜儀：安捷倫科技（美國(guó)）有限公司產(chǎn)品；pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式恒溫振蕩器：常州諾記儀器有限公司產(chǎn)品；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf（艾本德）生命科學(xué)公司產(chǎn)品；圓周振蕩器：IKA（艾卡）集團(tuán)產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 芝麻含油率的測(cè)定按照GB/T 11761—2006方法測(cè)定。測(cè)得實(shí)驗(yàn)中所用芝麻含油率為59.44%，符合一級(jí)制油用芝麻含油指標(biāo)。

1.3.2 芝麻醬的制備方法將芝麻過(guò)水清洗后，瀝水晾干至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.8%；在液壓平底鍋炒制，溫度控制為170℃；經(jīng)揚(yáng)煙后入石磨研磨，控制料溫89℃，磨漿轉(zhuǎn)速：35～38 r/min；取磨完的醬入兌漿鍋備用。

1.3.3 水酶法酶解工藝酶解液制備：稱(chēng)取50 g蒸餾水，水浴加熱至酶的最適溫度45～60℃，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH將pH調(diào)節(jié)至酶的最適pH，稱(chēng)取1 g酶加入調(diào)好pH的溶液中，攪拌至完全溶解備用。

工藝流程：稱(chēng)醬→加水→搖勻→加酶→調(diào)節(jié)pH→酶解→滅酶→冷卻離心→取油。

具體步驟：稱(chēng)取3份芝麻醬各20 g，放入3個(gè)酶解搖瓶中，依次加入55℃蒸餾水20 g以及10.2 g配制的酶液，攪拌均勻，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至酶的最適pH值，置于50℃恒溫振蕩水浴鍋中以150 r/min酶解8 h，取出加熱至沸騰滅酶3 min。冷卻至室溫，倒入離心管，8 000 r/min離心5 min，分取油水層。

1.3.4 酶的選擇通過(guò)分析芝麻素酚糖苷的結(jié)構(gòu)，考察具有水解糖苷作用的不同種類(lèi)酶的酶解效果，選出6種效果較好的酶，并比較酶解后芝麻素酚含量以及酶解的穩(wěn)定性進(jìn)一步篩選適宜的酶。

6種酶的最適作用條件為：Rapidase sensation、Rapidase fiber、Bakezymewholegain和Brewerscompass酶的最適pH值為5.7，最適溫度為45～55℃；Aromase H2和Cellulase A酶的最適pH值為4.5，最適溫度為50～60℃。

1.3.5 單因素試驗(yàn)以芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)和芝麻油酸價(jià)為指標(biāo)，分別考察不同酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量（芝麻醬質(zhì)量的百分比）、pH值和料液比對(duì)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)和芝麻油酸價(jià)的影響。

1.3.6 芝麻素酚的定量檢測(cè)稱(chēng)取0.5 g芝麻油，依次用8、8、5 mL甲醇充分振搖提取，離心后合并3次上清液，定容至25 mL，搖勻后經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，用HPLC外標(biāo)法定量檢測(cè)芝麻素酚的含量。用無(wú)水甲醇逐級(jí)稀釋芝麻素酚標(biāo)準(zhǔn)品，配制成一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.9、13.8、69、138、276、690 ng/μg溶液，繪制成橫坐標(biāo)為芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)x，縱坐標(biāo)是芝麻素酚峰面積y的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=17.057 7x-101.819 9。

1.3.7 酸價(jià)的檢測(cè)水酶法提取芝麻油的酸價(jià)測(cè)定按GB 5009.229—2016方法測(cè)定。

1.3.8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間、酶解溫度和料液比為關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，以芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)和芝麻油酸價(jià)為相應(yīng)指標(biāo)，共設(shè)計(jì)5個(gè)中心點(diǎn)和17個(gè)不同組合的試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平及編碼Table 1 Factors and levels used in response surface experiments

1.3.9 數(shù)據(jù)處理單因素試驗(yàn)、酸價(jià)檢測(cè)均重復(fù)3次，取平均值，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Design-Expert V8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對(duì)制取芝麻油中木脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

在酶解溫度和pH分別為各酶的最適條件、加酶量為1%、酶解時(shí)間為24 h和料液比為1∶1.5（g∶g）的條件下，不同種類(lèi)酶解對(duì)制取芝麻油中木脂素的影響如表2所示。由表2可知，不同種類(lèi)的酶酶解效果存在明顯差異。其中Aromase H2酶解效果最佳，酶解后芝麻素酚糖苷轉(zhuǎn)化為芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，較不加酶對(duì)照組芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了3 150.2 mg/kg。其次是Rapidase sensation，Bakezyme wholegain，Brewers compass，但這3種酶重復(fù)性較差，可能是由于酶的均一性不好、酸性條件下穩(wěn)定性不佳等原因?qū)е拢赃x擇Aromase H2作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用酶。

表2 不同酶對(duì)芝麻油中木脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of different enzymes on the content of lignans in sesame oil

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響酶解時(shí)間對(duì)酶解效果及酸價(jià)的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酸價(jià)呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì)，且8 h之前酶解速率較快。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，植物細(xì)胞壁逐漸被破壞，酶與底物反應(yīng)加快，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之增加。8 h之后酶解速率變慢，這是由于可提取出的芝麻油濃度逐漸降低，酶活力降低，提取速率也隨之減慢。當(dāng)酶解8 h時(shí)，芝麻油酸價(jià)為2.32 mg/g（以KOH計(jì)，下同），符合國(guó)標(biāo)一級(jí)芝麻油標(biāo)準(zhǔn)酸價(jià)≤2.5 mg/g；當(dāng)酶解12 h時(shí)，酸價(jià)為2.59 mg/g＞2.5 mg/g，超出一級(jí)芝麻油標(biāo)準(zhǔn)的范圍。酶解24 h時(shí)油品已酸敗，無(wú)法食用。所以選擇8 h為最佳酶解時(shí)間。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on sesaminol and acid value in sesame oil

2.2.2溫度對(duì)酶解效果影響溫度對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，芝麻油的芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酸價(jià)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為55℃時(shí)，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且酸價(jià)符合一級(jí)芝麻香油國(guó)標(biāo)要求，所以選擇55℃為最佳酶解溫度。

圖2 酶解溫度對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on sesaminol and acid value in sesame oil

2.2.3 加酶量對(duì)酶解效果的影響加酶量對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著加酶量的增大，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，加酶量到1%后有降低趨勢(shì)，其原因可能是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系酸性增強(qiáng)影響了酶的活性，酶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化速度降低；同時(shí)酸價(jià)隨著加酶量的增加而增大。當(dāng)加酶量為1%時(shí)，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且酸價(jià)符合一級(jí)芝麻香油國(guó)標(biāo)要求，所以選擇1%加酶量為最佳加酶量。

圖3 加酶量對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on sesaminol and acid value in sesame oil

2.2.4 pH對(duì)酶解效果的影響pH對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著pH的升高，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，pH為4.5時(shí)，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，當(dāng)pH＞4.5，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，說(shuō)明增大pH對(duì)Aromase H2的酶活影響明顯。芝麻油的酸價(jià)呈現(xiàn)先緩慢升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，酸價(jià)符合一級(jí)芝麻香油國(guó)標(biāo)要求，所以選擇pH 4.5為最佳pH條件。

圖4 pH值對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響Fig.4 Effect of pH value on sesaminol and acid value in sesame oil

2.2.5 料液比對(duì)酶解效果的影響料液比對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響如圖5所示。從圖5可以看出，隨著料液比的增大，芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，因?yàn)榱弦罕仍龃螅锪狭鲃?dòng)性提升，酶與底物的接觸面增大，酶解速度加快，酶解產(chǎn)物增加。料液比達(dá)1∶1.5（g∶g）后，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，結(jié)合酸價(jià)變化趨勢(shì)，加水量增多，體系酸性增強(qiáng)，酶活性降低，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。隨著料液比進(jìn)一步增大，當(dāng)料液比超過(guò)1∶2（g∶g）時(shí)，游離芝麻油的出油率顯著降低，這是因?yàn)樗^(guò)多而導(dǎo)致乳化嚴(yán)重，無(wú)法離心取油。所以，當(dāng)料液比為1∶1.5（g∶g）時(shí)，芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且酸價(jià)符合一級(jí)芝麻香油國(guó)標(biāo)要求，所以選擇料液比1∶1.5（g∶g）作為最佳料液比條件。

圖5 料液比對(duì)芝麻素酚及酸價(jià)的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on sesaminol and acid value in sesame oil

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果本研究通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化高芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)芝麻油制備工藝參數(shù)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定Aromase H2酶、最適溫度55℃和最適pH 4.5，選擇提取時(shí)間、加酶量、料液比為自變量，以芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和芝麻油的酸價(jià)為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Table 3 Box-Behnken design matrix and response values for the yield and purity of phycoerythrin from laver

2.3.2 模型的建立及顯著性分析基于參數(shù)評(píng)估，運(yùn)用Design-Expert V8.0軟件可得出響應(yīng)值與被檢變量之間的邏輯關(guān)系。對(duì)這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得編碼應(yīng)變量對(duì)編碼自變量的關(guān)系為：Y1=2 830.05+202.98A+137.39B+8.95C；Y2=2.33+0.32A+0.26B+0.21C-0.13AB+0.17AC+0.02BC＋0.17A2+0.20B2+4.25×10-3C2。

從表4中可以看出，模型P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.205 5＞0.05，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明可用此模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；R2=0.937 9，說(shuō)明該回歸方程擬合度較好；CV=1.75%，說(shuō)明其置信度較高；信噪比RSN=28.357，模型可調(diào)整確定系數(shù)，說(shuō)明數(shù)據(jù)有較高可靠性。由F值可知，3個(gè)考察因素對(duì)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響依次為：A＞B＞C。回歸方程中沒(méi)有交互項(xiàng)和二次項(xiàng)，說(shuō)明各因素對(duì)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響沒(méi)有交互作用。其原因可能是酶解時(shí)間對(duì)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響遠(yuǎn)超過(guò)加酶量和料液比的緣故。

表4 基于酶解芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression model based on the content of sesaminol

從表5中可以看出，模型P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.080 1＞0.05，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明可用此模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；R2=0.995 1，說(shuō)明該回歸方程擬合度較好；CV=1.57%，說(shuō)明其置信度較高；信噪比RSN=40.382，模型可調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.988 8，說(shuō)明數(shù)據(jù)有較高可靠性。由F值可知，3個(gè)考察因素對(duì)芝麻油酸價(jià)的影響依次為：A＞B＞C。模型中A2、B2、AB、AC對(duì)芝麻油酸價(jià)影響極顯著，其余項(xiàng)為不顯著。

表5 基于芝麻油酸價(jià)的回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance in regression model based on the acid value of sesame oil

2.3.3 各因素交互影響的響應(yīng)面分析各因素對(duì)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響及各因素的交互作用如圖6，各因素對(duì)芝麻油酸價(jià)的影響及各因素的交互作用如圖7。由圖6可以看出，AB、AC交互作用響應(yīng)面圖是一個(gè)平面，影響不顯著；無(wú)法得到BC交互作用的響應(yīng)圖，說(shuō)明A的影響大。由圖7可以看出，AB、AC對(duì)酸價(jià)的影響極顯著，使得響應(yīng)面坡度較陡；BC交互作用響應(yīng)面圖坡度較平緩，影響不顯著[19]。因此各個(gè)因素之間的關(guān)聯(lián)作用為：AB＞AC＞BC。

圖6 各因素對(duì)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of factors on the content of sesaminol

圖7 各因素對(duì)芝麻油酸價(jià)的交互作用響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of factors on acid value of sesame oil

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析由單因素結(jié)果以及回歸方程得出水酶法制備高芝麻素酚芝麻油的最佳工藝條件為酶解溫度55℃、酶解pH 4.5、酶解時(shí)間為9.2 h、Aromase H2酶添加量1.03%、料液比1∶1.3（g∶g），在此工藝條件下預(yù)測(cè)芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 964.1 mg/kg，酸價(jià)為2.30 mg/g。為驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化工藝結(jié)果可靠性，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮實(shí)際操作條件，將預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為酶解溫度55℃、酶解pH 4.5、酶解時(shí)間為9.2 h、Aromase H2酶添加量1%、料液比1∶1.3（g∶g），結(jié)果顯示芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值為2 892.5 mg/kg，與預(yù)測(cè)值相差71.6 mg/kg，酸價(jià)為2.29 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差0.01，證明結(jié)果可信度較高，可有效對(duì)水酶法制備高芝麻素酚芝麻油工藝進(jìn)行優(yōu)化及分析預(yù)測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)水酶法提取芝麻油，將水溶性的芝麻素酚糖苷轉(zhuǎn)化為油溶性的芝麻素酚，從而提高芝麻油中的芝麻素酚含量。水酶法提取芝麻油的過(guò)程中，酶解條件的改變對(duì)芝麻油酸價(jià)影響較大，考慮到芝麻油的可食用性，最大限度增加芝麻油芝麻素酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)同時(shí)，兼顧了水酶法提油對(duì)酸價(jià)的影響。響應(yīng)面優(yōu)化了水酶法制備高芝麻素酚芝麻油工藝，得到的最佳提取工藝為：酶解溫度55℃、酶解pH 4.5、酶解時(shí)間為9.2 h、Aromase H2酶添加量1%、料液比1∶1.3（g∶g）。在該條件下，芝麻油中芝麻素酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近3 000 mg/kg，木脂素總量提高約23%，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，酸價(jià)2.29 mg/g，符合一級(jí)芝麻油標(biāo)準(zhǔn)。