鴨蛋卵清蛋白多肽的酶解條件優化及生物活性

王 倩，賀 萍，劉 琪，曾凡珂，張曉元，賴富饒，吳 暉*，

（1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州510640；2.韶關市華工高新技術產業研究院，廣東 韶關512027）

鴨蛋卵清蛋白約占鴨蛋總蛋白質的54%，是蛋清中最主要的蛋白質，且含有豐富的Ile、Leu、Met、Val和Phe。卵清蛋白營養價值較高，具有良好的蛋白質膠凝、乳化和起泡等功能特性，可在食品加工中賦予食品特殊的口感和風味[1]。關于卵清蛋白的研究主要集中在功能及物理特性的改性[2-3]、卵清蛋白與多糖、亞油酸制備納米顆粒復合物[4-6]和制備生物活性肽[7-8]等方向。

生物活性肽的制備一般有酶解法、微生物發酵法和人工合成法。酶解法因操作簡便、可工業化生產的優點而被大量采用。宋宏新[9]用DPPH自由基清除率和水解度為指標，用堿性蛋白酶水解雞蛋卵白蛋白制備抗氧化活性肽，其產物的DPPH自由基清除率達到了96.92%，唐文婷[10]利用pepsin和trypsin復合水解卵白蛋白，再通過純化分離得到2個具有抗菌活性的多肽組分，劉麗莉[11]探究了雞蛋卵清蛋白的酶解工藝和產物的結構性質，結果發現采用堿性蛋白酶水解，樣品水解度可達到26.55%，Chamila[12]考察了幾種蛋白酶從蛋清中釋放抗氧化肽的能力，選擇了蛋白酶P1從卵白蛋白、卵轉鐵蛋白和半胱氨酸抑素中分離得到16條抗氧化肽。酶解法以簡單易控制的優點已經被廣泛應用于蛋白酶解產物的制備中。

文獻中報道的動植物蛋白經酶解制備的多肽活性主要包括抗氧化、抗菌[13]、鈣螯合[14]、抗癌[15]、抗高血壓[16]、降血壓[17]和免疫調節[18]等。 任堯[19]報道了雙酶水解鴨蛋蛋清多肽制備抗氧化肽的方法，陳功[20]報道了堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解咸鴨蛋脫鹽蛋清制備抗氧化肽的工藝，Cho等[21]比較了Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、Protamex和Ficin 5種蛋白酶對雞蛋蛋清蛋白的水解作用，發現中性蛋白酶水解產物的水解度和α-氨基酸產量最高；陳棟梁等[22]的研究表明雞蛋卵清蛋白的復合蛋白酶水解產物對BALB/c小鼠的體液免疫和細胞免疫均有顯著增強作用。以上研究表明以鴨蛋卵清蛋白為原料，采用酶解法獲得一種具有多種生物活性的多肽產物具有可行性，同時也為鴨蛋的開發利用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨蛋卵清蛋白，實驗室制備（pH 4.5下60%飽和度硫酸銨沉淀所得，蛋白質總氮質量分數86.7%）；RAW 264.7細胞，購自廣東省中醫院；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶，購自上海源葉生物試劑公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2’-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉）二胺鹽（ABTS）、2，2’-偶 氮 （二 異 丁 基 脒） 二 鹽 酸 鹽（AAPH），購自Sigma公司；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。Infinite M1000 Pro酶標儀，購自瑞士Tecan公司；高速冷凍離心機，購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；HERAcell 150 iCO2培養箱，購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶酶活的測定蛋白酶酶活測定的方法參考李艷紅[23]略做修改。稱取100 mg（或100μL）酶 分 別 置 于1、2號 管 中，3號 管 加 入100μL的0.02 mol/L pH 8.00磷酸鈉緩沖液進行溶解定容，稀釋1 000倍。取稀釋后的樣品酶液1 mL分別置于試管中37℃預熱3 min，加入2 mL 1 g/dL酪蛋白溶液，在37℃水浴15 min。在1、2、3號管中立即加入3 mL 10 g/dL三氯乙酸，4 500 r/min離心10 min。取上清液0.5 mL，加0.55 mol/L碳酸鈉2.5 mL，福林酚試劑0.5 mL，37℃水浴中避光孵育15 min，最后在680 nm下測定吸光值。以L-酪氨酸做標準曲線，3號管為空白對照。

酶活力單位定義：在37℃下每分鐘水解酪蛋白產生1μg L-酪氨酸為一個酶活單位，U/（g·min）。

式中，A為根據標準曲線換算的L-酪氨酸質量濃度（μg/mL）；F為稀釋倍數；V為混合液體積（mL）；t為反應時間（min）；W為酶質量（g）。

1.2.2 水解度的測定取250μL酶解上清液，加入2.0 mL 0.212 5 mol/L pH 8.20磷酸鹽緩沖液和1.0 mL體積分數0.01% TNBS，50℃下避光孵育30 min，加入2 mL 0.01 mol/L的Na2SO3終止反應，冷卻至室溫后在420 nm下測量吸光值。以L-亮氨酸繪制標準曲線，計算出α-氨基酸含量。

式（2）中，DH為水解度（%）；Lt為時間t時釋放的α-氨基酸（mmol/L）；L0為鴨蛋卵清蛋白原始的α-氨基酸（mmol/L）；Lmax為鴨蛋卵清蛋白在用6 mol/L HCl在100℃下水解24 h后的總氨基酸量（mmol/L）。

1.2.3 水解酶的篩選鴨蛋卵清蛋白用蒸餾水溶解，配制成1 g/dL的蛋白質溶液，分別取100 mL溶液至5個250 mL錐形瓶中，按照表1的條件進行酶解，加酶量均為2×104U/（g·min），酶解時間3 h，分別測量酶解上清液的水解度，確定最佳的鴨蛋卵清蛋白水解酶，并采用正交實驗確定最佳酶解條件。

表1 酶的特性Table 1 Enzyme characteristics

1.2.4 單因素實驗設計

1）最佳酶解時間的篩選 根據1.2.3的結果選擇木瓜蛋白酶進行后續酶解實驗。選擇酶解時間分別為1、2、3、4、5、6 h進行單因素實驗。根據1.2.3的結果選擇木瓜蛋白酶，酶解pH 7.50，加酶量為2×104U/（g·min），在50℃下酶解，通過測定樣品的水解度選擇最適宜的酶解時間。

2）加酶量的篩選 選用加酶量分別為1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104U/（g·min），酶解pH 7.50，在50℃下加入木瓜蛋白酶酶解3 h，通過樣品的水解度選擇最適宜的加酶量。

3）酶解溫度的篩選 選擇酶解溫度分別為40、45、50、55、60℃，酶解pH 7.50，加入木瓜蛋白酶酶解3 h，加酶量為2×104U/（g·min），通過測定樣品的水解度選擇最適宜的酶解溫度。

4）酶解pH的篩選 選擇酶解pH分別為5.00、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00，加入木瓜蛋白酶酶解3 h，加酶量為2×104U/（g·min），在50℃下酶解，通過測定樣品的水解度選擇最適宜的酶解pH。

1.2.5 正交試驗設計在單因素試驗的基礎上，以水解度為考察對象，每個因素選取3個水平，建立正交試驗因素水平表，通過L9（34）正交試驗對鴨蛋卵清蛋白水解條件進行優化設計，正交實驗設計見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels for orthogonal test

1.2.6 HD相對分子質量的測定采用HPLC進行相對分子質量的測定。配制1 mg/mL的HD溶液，過0.22μm的濾膜后進色譜柱TSK gel 2000SWXL（300 mm×7.8 mm）。流動相：乙腈/水/三氟乙酸（20∶80∶0.1，體積比），檢測波長220 nm，流量0.5 mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL。用細胞色素C（相對分子質量12 500）、抑肽酶（相對分子質量6 500）、桿菌肽（相對分子質量1 450）、乙酰基四肽GGYR（相對分子質量451.2）和還原型谷胱甘肽（相對分子質量307.3）作為相對分子質量校正標準[25]。

1.2.7 HD的免疫活性評價細胞免疫活性測定參考張婷等[26]的方法。接種100μL細胞濃度1×106個/mL的RAW 264.7細胞懸液于96孔板中，CO2培養箱培養24 h后，吸去上清液，加入100μL不同質量濃度（1 000、500、250、125、62.5μg/mL）的HD溶液，陽性對照組為20μg/mL的LPS，空白組為DMEM培養基，再培養24 h后收集細胞上清液，用試劑盒檢測上清液中NO、TNF-α和IL-6的表達量。

1.2.8 HD對AAPH誘導的紅細胞溶血的保護作用參考Ma等[27]的方法略做修改。取新鮮抗凝羊血10 mL，1 200 g離心5 min，取沉淀。再用pH 7.4的PBS清洗5次后配制成體積分數20%的紅細胞懸浮液。用PBS將樣品配制成不同質量濃度（1 000、750μg/mL和500μg/mL），在試管中加200μL樣品和200μL紅細胞懸液，37℃孵育30 min后，加入400μL AAPH（200 mmol/L）孵育1.5 h，加入5 mL PBS稀釋樣品后1 200 g離心10 min，取上清液在540 nm下測定吸光值A。全溶血組用蒸餾水替代PBS，其吸光值記為B。

1.2.9 HD的體外抗氧化活性評價

1）DPPH自由基清除能力 參考You[28]的方法。取2 mL不同質量濃度的HD溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液混勻，避光反應30 min后于517 nm測定吸光度，用Trolox作陽性對照。

2）ABTS+·自由基清除能力 參考Zhang[29]的方法略做修改。取400μL不同質量濃度的HD溶液，加4 mL ABTS+·反應液，避光反應20 min后，于734 nm下測吸光值。以Trolox作為陽性對照。

3）ORAC法測定樣品體外抗氧化能力 參考王光[30]的方法略做修改，在96孔板中加入25μL樣品（質量濃度分別為1 000、500、250、125、62.5μg/mL）、25μL的403.2 nmol/L熒光素鈉，37℃下預熱5 min，用排槍加150μL 17.07 mmol/L的AAPH啟動反應，在485/338 nm下進行連續測定2 h，設定每5分鐘測量一次熒光值。以Trolox作陽性對照，同時設定只加熒光素鈉的熒光自然衰減組對照、加蒸餾水的空白對照組。

公式（6）中，AUC樣品為樣品的積分面積；AUC+AAPH為加PBS組的積分面積；n為Trolox的摩爾濃度（μmol/L）；c為樣品質量濃度（μg/mL）。

1.3 數據處理

所有試驗均做3組平行，結果以平均值±標準方差（mean±SD）表示。采用Origin 8.5、SPSS 17.0和正交設計助手V3.6進行結果統計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶的酶活測定

根據L-酪氨酸測定的標準曲線為：y=0.008 9x+0.030 5，R2=0.999 1。5種蛋白酶的酶活測定結果見表3，5種蛋白酶的酶活大小存在顯著性差異（P＜0.05），風味蛋白酶和復合蛋白酶的酶活最高，中性蛋白酶的酶活最低。實驗中測定的5種蛋白酶的實測酶活略高于李艷紅[23]的實驗結果，推測原因是蛋白酶的酶活與其存放條件和存放時間有關，存放越久酶活越低，蛋白酶的實測酶活就可能低于其標注酶活，因此為了試驗的準確性，對本實驗中用到的5種酶進行酶活標定，以便試驗結果的統一。

表3 5種蛋白酶的實測酶活Table 3 Enzyme activities of 5 proteases

2.2 5種水解酶的篩選

蛋白酶的種類是影響酶解效率的重要因素之一，因底物與酶的特異性結合位點的不同而顯示出差距。Doucet報道[31]堿性蛋白酶可水解蛋白質中的Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gln的羧端肽鍵且相對大的氨基酸側鏈的肽鍵；中性蛋白酶可以水解羧端為Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸的肽鍵；復合蛋白酶為一種溫和的蛋白質內切酶，對酰胺基的水解能力較弱；風味蛋白酶的作用較為廣泛，而木瓜蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶類，能裂解堿性氨基酸、亮氨酸或甘氨酸的肽鍵。由圖1可知，木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和堿性蛋白酶水解產物的水解度較大，而中性蛋白酶的水解度最小，可能是因為鴨蛋卵清蛋白中的Glu、Leu、Lys和Gly含量較高，而芳香族氨基酸含量偏低，從而導致這種結果。木瓜蛋白酶可以特異性水解鴨蛋卵清蛋白中的肽鍵，從而可以釋放出更多的α-氨基酸，因而其產物的水解度最高。

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 酶解時間的篩選由圖2可知，隨著酶解時間的延長，水解度呈現先上升后逐漸平緩的趨勢，且當時間到達5 h后，水解度達到了 （24.74±0.63）%，隨著酶解時間延長水解度未顯著升高（P＜0.05），推測其原因是酶具有專一性，隨著酶解時間的延長，特定位點的肽鏈已經大部分水解，因而水解度不會隨著時間的無限延長而不斷增加。因此后續選取4、4.5、5 h展開正交實驗，探究最佳的酶解時間。

圖1 5種蛋白酶對水解度的影響Fig.1 Effect of five proteases on hydrolysis degree

圖2 酶解時間對水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree

2.3.2 加酶量的篩選由圖3可知，加酶量對水解度的影響趨勢和酶解時間類似，呈現出先增加后平緩的趨勢，當加酶量為4×104U/（g·min）時，水解度為（27.40±0.71）%，隨著加酶量的增加，水解度基本保持不變，說明此時體系中底物與酶結合位點已經接近飽和，只增加體系中蛋白酶的量不能提高上清液中肽的水解度，也會造成資源的浪費。因此后續選擇3.5×104、4.0×104U/（g·min）和4.5×104U/（g·min）進行正交實驗，探究最適宜的加酶量。

2.3.3 酶解溫度的篩選酶解溫度也是影響酶解效率的條件之一，由圖4可知，當酶解溫度在40～60℃之間變化時，水解度先增加后降低，在50℃時水解度達到最高為（25.81±0.65）%，與李艷紅[19]報道的木瓜蛋白酶最適溫度55℃相符。因此后續設定45、50℃和55℃進行正交實驗，探究最佳實驗條件。

圖3 加酶量對水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on hydrolysis degree

圖4 酶解溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree

2.3.4 酶解pH的篩選木瓜蛋白酶的最適pH為6.00～7.00，所以本研究中選擇pH 5.00～8.00進行探究。由圖5可知，木瓜蛋白酶的水解度隨著pH的升高呈現先增加后降低的趨勢，當pH為6.50時水解度達到最高為（26.32±1.75）%，為探究最適宜酶解pH，選擇pH值6.20、6.40和6.60進行正交實驗。

圖5 酶解pH對水解度的影響Fig.5 Effect of pH on hydrolysis degree

2.4 正交實驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，對酶解時間、加酶量、酶解溫度和酶解pH展開L9（34）正交試驗，探究最優水平，正交試驗設計見表2，鴨蛋卵清蛋白酶解正交試驗結果見表4。

由表4可知，通過正交試驗結果的極差分析可知對水解度影響大小排序為A＞B＞C＞D，最優解A3B3C3D2，即通過正交試驗得出木瓜蛋白酶的最佳水解條件為，水解時間為5.5 h，加酶量為4.5×104U/（g·min），酶解溫度為55℃，酶解pH 6.40。采取此條件進行驗證實驗，經驗證此條件下木瓜蛋白酶水解鴨蛋卵清蛋白的水解度為（27.91±0.57）%，表明該優化取得了較好的效果。后續實驗均采用此優化結果制備鴨蛋卵清蛋白木瓜蛋白酶酶解產物（HD），并進行進一步分析。

表4 正交試驗結果Table 4 Orthogonal test results

2.5 HD的相對分子質量分布

采用高效液相色譜法進行酶解產物的相對分子質量分布測定，利用標準品的保留時間與lg（Mw）做線性回歸方程：y=-0.204 2x+6.790 6，R2=0.974 6。標準品與樣品的高效滲透色譜圖見圖6。因此可求得鴨蛋卵清蛋白在經過木瓜蛋白酶水解后相對分子質量分布范圍為：Mw＜300占33.71%、300＜Mw＜450占29.21%、450＜Mw＜1 450占20.42%、1 450＜Mw＜6 500占0.49%、6 500＜Mw＜12 500占5.05%、Mw＞12 500占11.12%。其 中Mw＜1 450的 比 例 為83.35%，表明鴨蛋卵清蛋白經過木瓜蛋白酶水解后產生了較多的小分子肽段，而Doucet D[31]報道水解度大小和低相對分子質量肽段比例存在正相關，與本實驗結果相符。本實驗中采用優化后的條件進行卵清蛋白的酶解，卵清蛋白中的多肽片段被盡可能地分解，推測其原因是采用木瓜蛋白酶水解5.5 h后，卵清蛋白中的多肽鏈被分解，從而使得產物中小分子肽段比例增加，因而產物的相對分子質量分布大部分在1 500以下。

圖6 HD的高效凝膠滲透色譜圖Fig.6 High performance gel permeation chromatography of HD

2.6 HD的免疫活性評價

多肽的免疫活性已經被一些文獻報道，Wu[32]報道了利用5種蛋白酶酶解脫脂麥胚谷蛋白，其中堿性蛋白酶水解產物具有更好地促進脾細胞增殖、吞噬中性紅和促進細胞因子分泌的能力，Songyi Lin[33]報道了松子仁蛋白肽在3 000～10 000的產物PNMPP可增強ICR小鼠的先天性免疫和適應性免疫。如圖7所示，經過HD處理24 h的小鼠巨噬細胞RAW 264.7的上清液中NO、TNF-α和IL-6的含量均顯著高于空白組，說明以促進小鼠巨噬細胞RAW 264.7參與并促進機體炎癥反應，顯示出一定的免疫活性，從而顯示出具有一定的免疫活性。在圖7（a）中，當采用250μg/mL的HD處理細胞時，其NO分泌量達到了（42.37±1.05）μmol/L，是空白組的1.5倍，而在圖7（b）（c）中，TNF-α、IL-6分泌量分別達到了（854.77±12.13）pg/mL和（367.51±5.93）pg/mL，分別是空白組的4.09倍和2.39倍，均達到顯著水平（p＜0.01），表明HD在250μg/mL時即可刺激巨噬細胞分泌促炎因子，激發機體內非特異性免疫。當HD質量濃度達到1 000μg/mL時，3種細胞因子NO、TNF-α和IL-6分泌量分別達到陽性對照LPS（20μg/mL）的87.94%、59.10%和73.53%，推測HD可能具有類似于脂多糖的抗原性，但是相對于脂多糖其引起的非特異性免疫反應又較溫和，可能是一種潛在的免疫調節劑。

圖7 HD的免疫活性Fig.7 Immunological activity of HD

2.7 HD對AAPH誘導的紅細胞溶血的保護

AAPH可以在37℃熱分解產生烷基自由基，遇到氧氣時會被氧化形成氫過氧自由基。氫過氧自由基可以攻擊細胞膜與磷脂反應引起脂質過氧化從而破壞細胞膜的完整性，使紅細胞溶血，因此可以通過測定溶血抑制率間接反應樣品的體外抗氧化活性。

如圖8所示，加入1 000μg/mL樣品的毒性組與不加AAPH的正常組的抑制率均在80%以上，且無顯著性差異（P＜0.05），表明HD對人紅細胞無損傷作用，可以進行后續實驗。由圖8可知，加入HD后的樣品組（樣品+AAPH）中紅細胞溶血抑制率上升，且隨著質量濃度增加溶血抑制率也顯著增加（P＜0.05）。HD質量濃度達到1 000μg/mL時，其溶血抑制率為（53.95±1.82）%，溶血抑制率為空白組（只加PBS）的0.67倍，為AAPH損傷組（PBS+AAPH）的1.41倍，表明HD具有一定的紅細胞溶血抑制作用。與Chen[34]的實驗結果相比，HD在1 000μg/mL時的紅細胞溶血抑制率與純化后的SLT-3多糖在750μg/mL時的紅細胞溶血抑制率相當，表明HD具有清除氫過氧自由基的能力。

圖8 不同質量濃度的HD對紅細胞溶血的抑制作用Fig.8 Inhibition of HD for erythrocyte hemolysis at different concentrations

2.8 HD的體外抗氧化活性評價

HD的體外抗氧化活性評價如圖9所示。當HD的質量濃度為1 000μg/mL時，其DPPH、ABTS+·自由基清除率分別為（31.90±0.54）%和（86.41±2.12）%，均顯著高于空白組（P＜0.05），當HD質量濃度達到125μg/mL時，其ABTS+·自 由 基 清 除 能 力 與100μmol/L的Trolox無顯著性差異（P＜0.05），表明HD在125μg/mL時ABTS+·自由基清除能力與100 μmol/L的Trolox相當。分析其原因可能是HD中小分子多肽含量較高，其在水相體系中溶解度很好，因而具有較好的清除自由基能力。HD的ORAC值經換算為0.357 4μmol/mg，與Pádraigín A[35]的微藻多肽的ORAC值相當，表明HD還具有清除烷氧自由基的能力。但是HD的DPPH自由基清除率較小，可能是因為鴨蛋卵清蛋白經過木瓜蛋白酶酶解后，其中的高相對分子質量的蛋白質被分解為親水性的小肽以及游離的氨基酸，極性增加，使其難以捕捉疏水性的DPPH自由基[36]。綜合以上實驗數據，表明HD具有一定的體外抗氧化活性。

圖9 HD的體外抗氧化活性評價Fig.9 Evaluation of in vitro antioxidant activity of HD

3 結語

本實驗中探究了鴨蛋卵清蛋白的酶解條件，先以水解度為指標比較5種蛋白酶的水解效率，發現木瓜蛋白酶能特異性裂解鴨蛋卵清蛋白中Leu和Gly等堿性氨基酸間的肽鍵，具有最好的水解效果，再利用正交試驗探究木瓜蛋白酶水解的最佳條件，采用了L9（34）實驗比較了酶解時間、加酶量、酶解溫度和酶解pH對水解度的影響，最佳條件為：水解時間為5.5 h，加酶量為4.5×104U/（g·min），酶解溫度為55℃，酶解pH 6.40。經驗證此條件下水解度為27.91%，并以此為條件制備成鴨蛋卵清蛋白酶解產物（HD）進行后續實驗。

采用液相色譜法對HD進行相對分子質量分布區間表征，有如下分布：0＜Mw＜300、33.71%，300＜Mw＜450、29.21%，450＜Mw＜1 450、20.42%，1 450＜Mw＜6 500、0.49%，6 500＜Mw＜12 500、5.05%，Mw＞12 500、11.12%。相對分子質量分布數據表明鴨蛋卵清蛋白經過木瓜蛋白酶5.5 h水解后，Mw＜1 450的部分占83.35%，結果表明HD中小分子肽含量較多，與本實驗以水解度為指標進行酶解方案篩選有一定的關系，并推測小分子多肽含量高的HD可能具有一定的體外抗氧化活性和免疫調節活性。

本實驗對HD的免疫活性和體外抗氧化活性進行了進一步的探究。當采用250μg/mL的HD刺激小鼠巨噬細胞RAW 264.7時，其NO、TNF-α和IL-6分泌量分別達到了空白組的1.5倍、4.09倍和2.39倍，均達到顯著水平（P＜0.05），表明HD在較低質量濃度下即可刺激細胞分泌促炎因子激發機體內非特異性免疫。HD對AAPH誘導損傷的紅細胞溶血抑制實驗顯示，1 000μg/mL的HD對細胞無毒害作用，其溶血抑制率為（53.95±1.82）%，為空白組的0.67倍，為AAPH損傷組的1.41倍，表明HD可以保護羊紅細胞免受AAPH產生的氫過氧自由基的攻擊，顯示出一定的體外抗氧化能力。本實驗中還采用化學法對HD的體外抗氧化活性進行了評價，結果顯示當樣品質量濃度為1 000μg/mL時，其DPPH和ABTS+·自由基清除率分別為（31.90±0.54）%和（86.41±2.12）%，ORAC值為0.357 4μmol/mg，其DPPH自由基清除率較低可能是因為本實驗中獲得的多肽相對分子質量較小，在DPPH體系中難以捕捉疏水性自由基。活性探究實驗表明鴨蛋卵清蛋白酶解產物具有較好的免疫活性和體外抗氧化活性， 也為鴨蛋的開發利用提供了理論支撐。