家蠅3種絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)基因在感染白色念珠菌后的表達

胡 亞，羅 嫚，魏川川，修江帆，吳建偉*

(1. 畢節市第一人民醫院，貴州畢節 551700; 2. 貴州醫科大學基礎醫學院，貴陽 550004; 3. 畢節市中醫院，貴州畢節 551700; 4. 貴州省疾病預防控制中心，貴陽 550004)

昆蟲的免疫系統主要依賴于黑化作用(李殿香等，2013)、體液免疫及細胞免疫三者相互作用的免疫應答反應。當機體受病原體感染后，昆蟲體液免疫啟動脂肪體細胞合成抗菌肽(裴志花等，2014；Osama等，2014)并分泌到血淋巴中殺死入侵的病原體，不同的病原體通過激活Toll信號通路(Wangetal., 2013；Qianetal., 2014)和IMD信號通路(Lemaitre and Hoffmann, 2007)來控制各類抗菌肽分子的產生，但昆蟲先天免疫系統的抗菌肽表達等免疫應答反應，如果過度產生將會對宿主自身造成極大的損傷。因此對激活免疫應答的上游信號進行精確調節至關重要，而許多昆蟲的免疫應答都是由絲氨酸蛋白酶(Serine Protease, SP)級聯介導(Steven and Peter，2011)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)蛋白家族是一個成員眾多、分布廣泛的蛋白酶抑制劑家族(Singh and Jairajpuri，2014)，Serpin主要是通過使用自殺底物原理特異性地與靶酶形成穩定的共價復合物,導致靶酶失活，終止過度免疫應答反應，對宿主本身起著免受損傷的作用。其廣泛存在于動物、植物和微生物中(Hibbettsetal., 1999)，迄今已發現1 500多種Serpins(Lawetal., 2006)，根據其功能的相似性與序列拓撲結構至少可將其分為20個家族，大多數是糖蛋白，具有免疫調節活性(黃薇和吳坤陸，2010；楊偉克等，2014)。它們能折疊成保守的空間結構，且具有特異的類自殺性底物抑制機制(Irvingetal.，2000；Rubyetal.，2006；魏川川等，2016)。在動物體中，Serpin是維持體內環境穩定的重要因素，一旦基因平衡失調即會導致多種疾病，任何影響其活性的因素也會造成嚴重的病理性疾病(滿初日嘎等，2009; 張兵等，2014; 李冰等，2016)。Serpin可作為調節因子參與生理反應，可調節血液中的多種蛋白酶，調節酚氧化酶原活化反應，還參與調節機體多種非特異性免疫應答(Krowarschetal.，2003；張云，2006；韋雙雙等，2012；Gattoetal.，2013)。鑒于Serpin重要的免疫調節和生理功能，其功能研究一直倍受關注。

家蠅Muscadomestica是重要的媒介昆蟲，并且分布廣泛，隸屬于昆蟲綱雙翅目Diptera蠅科Muscidae家蠅屬Musca，具有強大的先天免疫系統及生長代謝調節功能(修江帆等，2014；彭傳林等，2015；王宇等，2015；胡亞等，2016)，已日益成為研究者們關注的焦點，為深入研究家蠅的先天性免疫防御機制，本研究通過白色念珠菌Canidiaalbicans刺激家蠅3齡幼蟲，對家蠅中具有潛在免疫調節功能的3種Serpin基因的時空表達模式進行研究，旨在為今后研究Serpin基因的生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2.1動物材料與菌種

家蠅由貴州醫科大學-基礎醫學院-病原生物學教研室保種，傳代繁殖，飼養溫度控制在25～28℃，保持相對濕度在70%～80%，光照周期為12 L ∶12 D；白色念珠菌由貴州醫科大學-基礎醫學院-病原生物學教研室保存。

1.2.2主要試劑與儀器

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit試劑盒、DEPC水、SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒、總RNA提取試劑TRIzol Reagent均購自Takara公司；氯仿和異丙醇購自西隴科學；去RNA酶EP管(美國Axygen公司)；PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)、微量加樣器(德國Eppendorf公司)、冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)、Milli-Q超純水儀(法國Millipore Pharmacia公司)、核酸定量分析儀(GeneQuant公司)、ABI PRISM 7300 Fast real time PCR System(美國)、顯微超微量注射儀(美國)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1引物設計

根據NCBI公布的GAPDH(內參基因)基因序列和家蠅Sp2、Sp13、Sp16基因預測序列，運用Primer 5.0軟件設計引物。交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如下(表1)：

表1 實驗引物

1.2.2標本制備

以濃度為1×1010CFU/mL的白色念珠菌作為感染源，利用顯微超微量注射儀注射家蠅3齡幼蟲，每頭注射210 nL，設置為感染組，同時以等體積的PBS緩沖液設為對照組，收集感染后不同時間點(3、6、12、24、36、48 h)和3、12、24、48 h各時間點的家蠅幼蟲組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)標本，存于-80℃備用。

1.2.3提取總RNA及合成cDNA

對所有感染標本，利用TRIzol提取總RNA，電泳檢測，運用GeneQuant公司核酸定量分析儀測定A260/280(1.8≤A260/280≤2.1)及濃度，以1 μg總RNA為模板合成cDNA第一鏈，置于-80℃待用。

1.2.4熒光定量PCR

取上述家蠅3齡幼蟲感染后不同時間點(3、6、12、24、36、48 h)及3、12、24、48 h各時間點的家蠅幼蟲組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)(感染組及對照組)cDNA(1 ∶10稀釋)為模板，設GAPDH為內參基因，按照Takara SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒使用說明，利用ABI PRISM 7300(USA)進行qPCR，每個樣品重復3×3次。反應體系為：2×SYBR premix EX Taq II 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、cDNA 1.0 μL, RNase Free dH20補足至20 μL。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃ 5 s；60℃ 34 s；40個循環。反應結束確認qPCR的擴增曲線和溶解曲線。

1.2.5數據處理及分析

利用GAPDH作為內參照，其拷貝數作為校正基數，感染組樣本中Serpin的△Ct值等于各樣本中Serpin的Ct值減去同樣本中GAPDH的Ct值；以對照組中△Ct值作為校正，得出△△Ct(感染組△Ct-對照組△Ct)值(胡亞等，2016)，按目的基因表達量=2-△△Ct計算各感染樣本中Sp2、Sp13、Sp16mRNA的相對表達量。采用Graphpad prism 6進行統計分析并繪圖，通過方差分析進行組間比較，P<0.05時具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 qPCR產物分析

根據qPCR原理，Ct值(Cycle threshold)表示每個反應管內的熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，以Ct值來反映目的基因cDNA起始含量，起始拷貝數越多，Ct值越小(胡亞等，2016)。結果顯示，所有樣本中Sp2、Sp13、Sp16cDNA顯示指數增長，其擴增曲線為典型的S型曲線并達到平臺期，CT值線性范圍為15～30(圖1，圖2，圖3)。在熔解曲線中均可見單一的峰，產物特異性好(圖4，圖5，圖6)。

2.2 感染組與對照組Sp2、Sp13、Sp16 mRNA水平

2.2.1 感染后不同時間點

白色念珠菌感染后，家蠅Sp2、Sp13、Sp16基因在不同時間點均顯現出差異表達。家蠅Sp2基因在感染后3 h時表達量最高，其次為48 h和6 h，均具有顯著性差異(P<0.05)，而在感染后12 h、24 h、36 h表達量差異無統計學意義(P>0.05)；家蠅Sp13基因在感染后6 h時表達量最高，而3 h和24 h時其表達量較對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)，在感染后12 h、36 h、48 h表達量差異無統計學意義(P>0.05)；家蠅Sp16基因在感染后48 h時表達量最高，其次為24 h和6 h，而在感染后36 h時其表達量較對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)，在感染后3 h和12 h表達量差異無統計學意義(P>0.05)(圖7)。

圖1 Sp2擴增曲線 Fig. 1 Amplification of Sp2 注：A，感染后不同時間點；B，感染后3 h不同組織；C，感染后12 h不同組織；D，感染后24 h不同組織；E，感染后48 h不同組織。圖2-圖6同。Note:A，Time post infection；B，Different tissues at 3 h postinfection；C，Different tissues at 12 h postinfection；D，Different tissues at 24 h postinfection；E，Different tissues at 48 h postinfection.Same to Fig.2-6.

圖2 Sp13擴增曲線 Fig.2 Amplification of Sp13

圖3 Sp16擴增曲線 Fig.3 Amplification of Sp16

圖4 Sp2溶解曲線Fig.4 Melting curve of Sp2

圖5 Sp13溶解曲線Fig.5 Melting curve of Sp13

圖6 Sp16溶解曲線Fig.6 Melting curve of Sp16

圖7 家蠅3種Serpin基因在感染后不同時間點的表達Fig.7 Expression of three Serpin gene in different time after Canidia albicans infection of Musca domestica 注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

2.2.2感染后不同組織

通過白色念珠菌刺激家蠅幼蟲，選擇感染后3 h、12 h、24 h、48 h時間點，分析Sp2、Sp13、Sp16基因在各組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)中的表達情況。家蠅Sp2基因在感染后3 h時，在血淋巴中的表達量最高，其次是在脂肪體中，均具有顯著性差異(P<0.05)，在馬氏管、氣管和腸道中其表達量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.05)；12 h時，在血淋巴中的表達量比對照組高，而在馬氏管和唾液腺中其表達量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)；24 h時，在脂肪體中的表達量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.01)；48 h時，在血淋巴中呈高表達，在唾液腺中的表達比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)(圖8)。家蠅Sp13基因在感染后3 h時，在唾液腺和脂肪體中的表達量比對照組高，而在馬氏管、體壁、血淋巴和氣管中的表達量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.05)；12 h時，在血淋巴中呈高表達，而在體壁和脂肪體中表達量比對照組低，均具顯著性差異(P<0.05)；24 h時，在血淋巴、氣管和唾液腺中其表達量比對照組高，在脂肪體中其表達量比對照組低，差異均具有顯著性(P<0.05)；48 h時，在馬氏管、血淋巴、氣管和脂肪體中其表達量比對照組高，而在體壁和唾液腺中其表達量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.05)(圖9)。家蠅Sp16基因在感染后3 h時，在馬氏管和氣管中的表達量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.01)；12 h時，在馬氏管和脂肪體中其表達量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.01)；24 h時，其表達量在馬氏管中比對照組高，在脂肪體中比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)；48 h時，在血淋巴中呈高表達，而在馬氏管中其表達量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)(圖10)。

圖8 Sp2在感染后不同組織中的表達Fig.8 Expression of Sp2 in different tissues after Canidia albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

圖9 Sp13在感染后不同組織中的表達Fig.9 Expression of Sp13 in different tissues after Canidia albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

圖10 Sp16在感染后不同組織中的表達Fig.10 Expression of Sp16 in different tissues after Canidia albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

3 結論與討論

家蠅孳生環境復雜，是重要的媒介昆蟲，其很少感染病原微生物，這和它自身強大的先天性免疫系統有關(胡亞等，2016)。而大量研究表明Serpin作為重要的免疫調控因子在先天性免疫調控作用中發揮重要作用，如煙草天蛾ManducasextaSerpin6參與了酚氧化酶原的激活(Zou and Jiang，2005)，家蠶Bombyxmori的Serpin家族中有5個基因已被證實具有免疫調節功能(鄭青亮等，2010；李游山等，2012)，且課題組前期構建系統發育樹分析家蠅Serpin基因結果表明(魏川川等，2016)，果蠅DrosophilaSerpin43Ac基因在機體發生過度免疫時，可通過抑制作用阻斷Toll信號通路的信號傳遞，抑制抗菌肽Drosomycin(Jean-Marc and Reichhart，2005)的表達，進而終止過度的免疫反應，在機體抵抗外界微生物感染中起到非常重要的作用(Greenetal.，2000)，它與家蠅Sp13和Sp16基因的親緣關系最接近。家蠅Sp2與黃粉蟲TenebriomolitorSerpinN48和SerpinN40親緣關系最近，而SerpinN48和SerpinN40已被證實為黃粉蟲天然免疫的重要負調控因子(Jiangetal.，2009；魏川川等，2016)，這為今后研究家蠅Sp2、Sp13和Sp16基因的生物學功能奠定了基礎。

本研究利用白色念珠菌刺激家蠅幼蟲，采用qPCR技術成功檢測了家蠅3種SerpinmRNA在家蠅幼蟲感染后不同時間點及不同組織中的表達情況。結果表明，家蠅3種Serpin基因在不同時間點呈現差異表達，家蠅Sp2基因在感染后3 h時表達量最高，其次是48 h和6 h，Sp13基因在感染后6 h表達量最高，而在3 h和24 h時其表達量比對照組低，Sp16基因在感染后48 h時表達量最高，其次是24 h和6 h，而36 h時其表達量比對照組低。以上結果分析表明，家蠅3齡幼蟲時期是家蠅整個生長發育過程中生長最快和最活躍的階段，當受到病原微生物刺激時，家蠅幼蟲卻能正常生長，推測Serpin基因可能參與了家蠅的個體生長發育，在抵抗外來微生物免疫防御過程中發揮著重要的作用，但3種Serpin基因在各時間點的表達各有差異，推測各Serpin基因之間能夠協同調控對外來微生物的免疫反應。

家蠅Sp2、Sp13和Sp16基因在家蠅幼蟲不同組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)中均有不同程度的表達，感染后Sp2和Sp13mRNA的表達量在血淋巴和脂肪體中普遍比對照組高，Sp13mRNA在3 h和24 h時在唾液腺中的表達量比對照組高，Sp16mRNA在24 h時，其表達量在脂肪體中比對照組低；48 h時，在血淋巴中呈高表達。有研究表明脂肪體和血淋巴是昆蟲的主要免疫器官，參與昆蟲的先天性免疫應答反應，唾液腺是昆蟲主要的消化器官，能夠分泌多種消化酶，在昆蟲的免疫防御系統中扮演著重要的角色。病原微生物感染家蠅時，通過信號通路調節抗菌肽的產生，當抗菌肽過度表達時，各免疫器官在相應時間高表達Serpin，通過其特異的類自殺性底物抑制機制終止過度免疫應答反應，使宿主內環境保持平衡，使得家蠅在感染病原體后能夠安然地生長繁殖，說明Sp2、Sp13、Sp16可能在家蠅的免疫防御系統中起著重要作用，同時3種Serpin基因在各組織中不同感染時間呈現出差異性表達，說明3種Serpin基因之間在家蠅免疫防御過程中有協同調節的可能。

通過qPCR結果分析，推測家蠅Sp2、Sp13、Sp16基因在免疫防御過程中擔當著重要角色，3種Serpin基因在各時間點不同組織中的表達各有差異，推測各Serpin基因之間具有協同調節作用，這為今后研究Serpin的生物學與免疫學功能打下堅實的基礎。