慢病毒介導的Jagged1 RNA干擾通過抑制肥大細胞的遷移、浸潤和脫顆粒減輕變應性鼻炎小鼠的炎癥

夏 翠 祝 康 鄭國璽 孫 斌 高天喜 趙 健

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種常見的異質性慢性上呼吸道疾病，是一種IgE介導的炎癥[1]。在AR過敏反應中，當變應原與IgE相互作用時，肥大細胞會激活[2]。抗原-IgE刺激后，肥大細胞釋放細胞因子介導急性和慢性炎癥[3]。Jagged1是Notch信號中Notch配體之一，AR發病過程中Jagged1的表達明顯增加，Notch1-Jagged1可能通過上調IL-6和IL-10的表達促進AR的發生和發展[4]。據報道，敲低Jagged1可抑制肥大細胞產生促炎性細胞因子[5]。在過敏性疾病中，呼吸道黏膜肥大細胞數量顯著增加，上皮細胞表達的Notch配體可通過增加該細胞產生促炎性細胞因子，促進炎癥的進展[6，7]。因此，在炎性組織中阻斷Jagged1可能是治療過敏性疾病的一種新策略。綜上所述，本研究旨在探究Jagged1通過調控肥大細胞遷移、浸潤和脫顆粒對變應性鼻炎小鼠的影響，以期為變應性鼻炎發病機制的探究及開發新的治療策略提供新的科學資料。

材料與方法

1.材料：卵清蛋白和氫氧化鋁購自美國Sigma Chemical公司；Trizol reagent、PrimeScriptTMRT reagen Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司；Jagged1和GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；shRNA陰性對照慢病毒液(sh-NC)和Jagged1 shRNA慢病毒(sh-Jagged1)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；組胺(HIS)、類胰蛋白酶(TPS)、前列腺素D2(PGD2)和小鼠卵清蛋白特異性IgE抗體(OVA-sIgE)ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

2.動物飼養：32只6～8周齡SPF級BALB/c小鼠購自湖南SJA實驗動物有限公司。所有動物飼養于鼠房，保持室內通風，確保充足飲水及飼料。

3.變應性鼻炎小鼠模型的建立：32只小鼠隨機分為4組：對照組、AR組、sh-NC組和sh-Jagged1組，每組各8只。AR組、sh-NC組和sh-Jagged1組小鼠在建模第1、8和15天腹腔注射100μg OVA，在第21～27天，每天用20μl OVA溶液鼻腔給藥進行兩次局部激發。對照組給予小鼠等量0.9%NaCl濃度。

4.Jagged1慢病毒干擾：在建模第1、7、14天和第21～27天每次激發前3h，AR組、sh-NC組和sh-Jagged1組小鼠分別經鼻給予20μl PBS、sh-NC慢病毒液和sh-Jagged1慢病毒液，對照組給予小鼠等量0.9%NaCl濃度。

5.鼻部癥狀評價及取樣：在最后一次使用OVA進行局部激發后，對各組小鼠進行鼻部癥狀評分[8]。當癥狀評分>5時，AR小鼠模型被認為造模成功。癥狀評分結束后，處死各組小鼠，收集骨髓，外周血和鼻黏膜并保存在-80℃保存備用。

6.RT-PCR法：取各組小鼠骨髓，外周血和鼻黏膜，Trizol法提取各樣品總RNA，并反轉錄成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制反應體系，每組設置3個重復。Jagged1上游引物：5′-CTTCAATCTCAAGGCCAGCC-3′,下游引物：5′-CAGGCGAAACTGAAAGGCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′,下游引物：5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′。反應條件為95℃ 30s,95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算Jagged1 mRNA表達。

7.Western blot法：收集各組小鼠骨髓，外周血細胞和鼻黏膜，RIPA裂解液裂解各樣品，BCA法測定上清液蛋白濃度。10%SDS-PAGE分離蛋白質，并轉至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2h。一抗Jagged1 抗體(1∶5000)和GAPDH抗體(1∶10000)于4℃條件下孵育過夜，二抗室溫下孵育1h。ECL化學發光反應試劑盒和化學發光成像儀檢測蛋白條帶。

8.HE染色和甲苯胺藍染色：用0.9%NaCl溶液沖洗小鼠鼻黏膜組織，10%多聚甲醛固定。常規石蠟包埋、切片，常規脫蠟至水，蘇木精、伊紅染色或0.1%甲苯胺藍液染色，光鏡下觀察其組織學變化。

9.電子顯微鏡分析：將小鼠鼻黏膜組織切成約1mm×1mm×1mm大小。4℃的2.5%戊二醛處理4h，1%四氯化銫中固定2h。常規脫水、組織包埋、超薄切片，2%醋酸鈾染色，檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

10.ELISA實驗：各組小鼠外周血，1000×g離心10min收集血清。按ELISA試劑盒說明書，測定黏膜，骨髓和血清中組胺、類胰蛋白酶、PGD2和血清中OVA特異性免疫球蛋白E(IgE)含量。

結 果

1.Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1 mRNA水平的影響：RT-PCR結果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中Jagged1 mRNA水平均升高(P<0.01，圖1)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠骨髓，外周血和鼻黏膜中Jagged1 mRNA水平均降低(P<0.01，圖1)。

圖1 Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1 mRNA水平的影響A.各組小鼠骨髓中Jagged1 mRNA水平；B.各組小鼠外周血中Jagged1 mRNA水平；C.各組小鼠鼻黏膜中Jagged1 mRNA水平；與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01

2.Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1蛋白水平的影響：Western blot法結果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中Jagged1 蛋白水平均升高(P=0.000，圖2)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠骨髓，外周血和鼻黏膜中Jagged1蛋白水平均降低(P<0.01，圖2)。

圖2 Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠Jagged1蛋白水平的影響A.各組小鼠骨髓中Jagged1蛋白水平；B.各組小鼠外周血中Jagged1蛋白水平；C.各組小鼠鼻黏膜中Jagged1 蛋白水平；與對照組比較，*P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01，##P=0.000

3.Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠模型鼻癥狀和OVA特異性IgE的影響：各組小鼠鼻部癥狀評分和ELISA結果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠癥狀評分升高(P<0.01，圖3A)，且均>5，表明AR小鼠造模成功，OVA特異性IgE表達升高(P<0.01，圖3B)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠癥狀評分和OVA特異性IgE表達降低(P<0.01，圖3)。

圖3 Jagged1 shRNA慢病毒對AR小鼠模型鼻癥狀和OVA特異性IgE的影響A.各組小鼠鼻部癥狀評分；B.各組小鼠OVA特異性IgE的表達；與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01

4.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜組織病理學變化的影響：HE染色結果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠的鼻中隔黏膜基膜破碎，黏膜下血管出現明顯擴張、充血現象，出現明顯的炎性細胞浸潤(P<0.01)。與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠的鼻中隔黏膜基膜損傷減輕，鼻黏膜水腫和黏膜下血管擴張得到改善，炎性細胞浸潤明顯減少(P<0.05，圖4)。

圖4 HE染色檢測Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜組織病理學變化的影響(×400)A.對照組；B.AR組；C.sh-NC組；D.sh-Jagged1組。與對照組比較，*P<0.01；與sh-NC組比較，#P<0.05

圖5 Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜纖毛結構的影響(×12000)A.對照組；B.AR組；C.sh-NC組；D.sh-Jagged1組

5.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜纖毛結構的影響：電子顯微鏡觀察各組小鼠鼻黏膜的纖毛結構，結果如圖5所示，在對照組中可以觀察到大量排列整齊、厚度均勻的纖毛，AR組和sh-NC組小鼠鼻黏膜上皮表面分泌物增多，纖毛大面積減少、排列紊亂；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠鼻黏膜纖毛排列整齊、均勻，分泌物減少。

6.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜肥大細胞浸潤的影響：甲苯胺藍染色結果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠的鼻黏膜組織中肥大細胞的數量明顯升高(P<0.01)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠的鼻黏膜組織中肥大細胞的數量明顯降低(P<0.05，圖6)。

圖6 甲苯胺藍染色檢測Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠鼻黏膜肥大細胞浸潤的影響(×400)A.對照組；B.AR組；C.sh-NC組；D.sh-Jangged1組。與對照組比較，*P<0.01；與sh-NC組比較，#P<0.05

7.Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠肥大細胞脫顆粒的影響：ELISA檢測結果顯示，與對照組比較，AR組和sh-NC組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中組胺、類胰蛋白酶和PGD2水平明顯升高(P<0.01，圖7)；與sh-NC組比較，sh-Jagged1組小鼠骨髓、外周血和鼻黏膜中組胺、類胰蛋白酶和PGD2水平明顯降低(P<0.01，圖7)。

圖7 Jagged1 shRNA慢病毒對小鼠肥大細胞脫顆粒的影響A.各組小鼠組胺水平；B.各組小鼠類胰蛋白酶水平；C.各組小鼠PGD2水平。與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與sh-NC組比較，#P<0.01，##P=0.000

討 論

變應性鼻炎嚴重干擾患者的日常生活[8]。目前，口服抗組胺藥被認為是治療AR的主要療法。然而，可用的抗組胺藥，可能會導致一系列不良反應。而鼻內皮質類固醇、白三烯受體拮抗劑和過敏原免疫療法成本高昂，也存在一些不良反應[9]。因此，探明AR的發病機制，尋找更為有效的治療靶點極其重要。

Jagged1是Notch配體之一，據相關報道，AR患者的Notch1和Jagged1的表達明顯升高[10]。這與AR進展和變應原IgE水平呈正相關。與AR組比較，抑制Notch表達，可降低AR患者的過敏癥狀、IgE水平及Notch1、Jagged1的表達。Notch信號可促進AR的發生、發展[11]。橘皮素通過抑制其表達減輕變應性鼻炎癥狀，降低血清OVA誘導IgE的產生[12]。本研究結果顯示，Jagged1 RNA干擾可改善AR小鼠癥狀、鼻黏膜病理學變化和鼻纖毛結構損傷，抑制IgE的產生。該研究結果與之前的研究結果一致。

相關實驗證明，在過敏性鼻炎反應早期，組胺能削弱上皮細胞的屏障功能，增強致病作用[13]。芍藥苷通過抑制組胺釋放而在活化的肥大細胞中發揮抗過敏作用[14]。前列腺素如PGD2也可導致血管擴張引起鼻水腫，增加血管通透性[15]。此外，已有證據顯示，在食物過敏小鼠模型中，敲低Jagged1可抑制食物抗原誘導的腸道肥大細胞增生，從而減輕過敏反應[16]。本研究結果顯示，慢病毒介導的Jagged1 shRNA可降低變應性鼻炎小鼠鼻黏膜中肥大細胞數量，抑制組胺、類胰蛋白酶和PGD2的釋放，以上結果表明，敲低Jagged1可抑制變應性小鼠肥大細胞遷移、浸潤和脫顆粒。

綜上所述，本研究結果表明，慢病毒介導的Jagged1 RNA干擾可能通過抑制肥大細胞遷移、浸潤和脫顆粒減輕變應性鼻炎小鼠的炎癥。該結果為治療變應性鼻炎提供了新的可能靶點，為開發新療法提供了新的科學依據。