PD-1在Graves病CD4+、CD8+T細胞中表達水平及作用機制

韓 輝 傅曉丹 俞健益 黃 佼 張險峰

Graves病(Graves′ disease，GD)是一種發病機制尚不完全清楚的自身免疫性疾病，主要發生在甲狀腺，但其臨床表現不局限于甲狀腺一個器官，還伴有多系統綜合征，包括高代謝綜合征、彌漫性甲狀腺腫、眼部癥狀和皮膚病變等[1]。目前對GD病因的認識主要分為3個方面。遺傳影響已被認為與GD的發病密切相關，多有家族史，且多發生于女性，約15%的患者發病與遺傳因素有關[2]。精神創傷也被認為是GD的發病因素，由于各種原因引起的過度興奮或過度抑郁可導致甲狀腺激素的過度分泌，這可能是由于在高應激狀態下腎上腺皮質激素的分泌急劇增加，從而改變了抑制性T淋巴細胞(Ts)或輔助性T細胞(Th)的活性有關[3]。免疫系統的異常也被認為是其中一個因素[4]，由于缺乏特異性的自身抗原耐受，甲狀腺刺激素受體(TSHR)在GD的發生、發展過程中起著重要的中介作用。

作為最常用的腫瘤免疫治療方法，程序化死亡受體1(PD-1)抑制劑的應用能夠激活T淋巴細胞，從而進一步促進人體免疫系統對惡性腫瘤細胞的殺傷作用[5，6]。PD-1是重要的免疫抑制分子，屬于CD28超家族成員，最初來源于凋亡的小鼠T細胞雜交瘤[7]。以PD-1為靶點的免疫調節在抗腫瘤、抗感染、抗炎、抗自身免疫性疾病、提高器官移植成活率等方面具有重要意義[8～10]。

本研究通過檢測GD患者外周血中PD-1的表達水平，探討其對淋巴細胞共培養體系中甲狀腺濾泡上皮細胞增殖及炎性因子的影響。

對象與方法

1.實驗對象:取2017年5月～2018年6月在杭州市第一人民醫院就診的12例Graves病患者外周血，12例健康體檢者采集等量外周血。樣本采集前，患者和健康體檢者徹夜禁食。將標本分成3部分，一部分保存在含有乙二胺四乙酸抗凝劑的試管中，用于采集外周血單個核細胞，另一部分用2500×g離心15min獲得血清，最后一部分直接作為外周血保存，全部保存在4℃冰箱中。所有受試者均簽署了知情同意書。該臨床試驗計劃已通過杭州市第一人民醫院醫學倫理學委員會的審查和批準。正常人甲狀腺細胞系Nthy-Ori3-1(BNCC340487)購自北京北納生物有限公司，在37℃含10%胎牛血清(10099141，美國Gibco公司)的90%RPMI1640(670089，美國Gibco公司)培養基中培養。Graves病診斷標準：①臨床甲亢癥狀和體征；②甲狀腺彌漫性腫大(觸診和B超證實)，少數病例可以無甲狀腺腫大；③血清TSH濃度降低，甲狀腺激素濃度升高；④眼球突出和其他浸潤性眼征；⑤脛前黏液性水腫；⑥甲狀腺TSH受體抗體(TRAb或TSAb)陽性；以上標準中①～③項為診斷必備條件，④～⑥項為診斷輔助條件。

2.ELISA法:ELISA法檢測血清和細胞培養液中細胞因子水平。干擾素-γ(PI511)、IL-4(PI618)、IL-17(PI550)和轉化生長因子-β(PT880)ELISA試劑盒均購自中國碧藍天生物公司。所有操作均按照制造商的說明書進行。

3.PBMC的分離：外周血用0.9%鈣(Ca+)和鎂(Mg+)離子PBS緩沖液(德國BioChrome AG公司)均勻稀釋，然后覆蓋在3ml Gradisol L制劑(波蘭Aqua Medica公司)上，然后在700×g下用密度梯度離心20min。用無菌移液管采集PBMCs，用無鈣、無鎂的PBS緩沖液沖洗。然后將細胞懸浮在1ml如上所述的相同的PBS緩沖液中，4℃保存。

4.流式細胞儀檢測:將獲得的外周血單個核細胞懸液以1×106的體積分布于試管中，在單克隆抗體(20μl)和熒光素的共同作用下室溫培養20min。檢測T淋巴細胞CD4+、CD8+細胞PD-1狀態的抗體清單及其同型對照購自美國BD Biosciences公司，如表1所示。然后，細胞在700×g下沖洗離心5min，用美國Becton Dickinson公司的FACS Calibur流式細胞儀(每次30000個細胞)分析，FACS Diva軟件6.13(BD)進行數據采集，CellQuest Pro軟件(美國Becton Dickinson公司)進行數據分析。流式細胞儀分析的最終數據為一系列單克隆抗體染色的細胞，結合熒光染色，以平均熒光強度(MFI)表示細胞膜上抗原表達的增強。

表1 檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞PD-1的抗體

5.CCK-8法:CCK-8法檢測Nthy-Ori3-1細胞與淋巴細胞共培養后的存活率。將體積為5×103個細胞的Nthy-Ori3-1細胞培養在96孔培養板中。在12、24和48h后，應用細胞計數試劑盒(中國Beyotime公司)按照制造商的建議檢測細胞活力，并使用El×800讀取器(美國Bio-Tek Instruments Inc公司)在450nm下進行測量。

結 果

1．GD患者炎性細胞因子水平:酶聯免疫吸附試驗(ELISA)顯示，與健康對照組比較，GD患者血清中所有炎性相關細胞因子(干擾素-γ、IL-4、IL-17和轉化生長因子-β)水平均顯著升高(P<0.05，圖1)。

圖1 GD患者血清IFN-γ(A)、IL-4(B)、IL-17(C)、TGF-β(D)水平與對照組比較，*P<0.05

2.GD患者外周血CD4+、CD8+T細胞水平及PD-1的表達水平：檢測GD患者和健康人PBMC中CD4+、CD8+T細胞的百分率，與健康人比較，GD患者CD4+T細胞數量增加，CD8+T細胞數量減少，CD4+/CD8+比值升高(圖2A～C)。同時，流式細胞儀還檢測到GD患者CD4+和CD8+T細胞中PD-1水平，兩種細胞中PD-1水平均顯著升高(圖2D～G)。

圖2 GD患者外周血CD4+、CD8+T細胞水平及PD-1的表達水平A、B.PBMCs中CD4+、CD8+T細胞百分率；C.CD4+/CD8+比值；D～G.外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+細胞膜上PD-1的水平；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

3.PD-1+T淋巴細胞促進共培養的甲狀腺濾泡上皮細胞增殖：選擇CD4+PD-1+/-、CD8+PD-1+T淋巴細胞與甲狀腺濾泡上皮細胞共培養，檢測其細胞活力及炎性相關細胞因子的表達，觀察其對甲狀腺濾泡上皮細胞增殖的促進作用。與CD4+PD-1+/-、CD8+PD-1+T淋巴細胞共培養的甲狀腺濾泡上皮細胞具有促進增殖作用。在CD4+和CD8+淋巴細胞上均存在PD-1可顯著提高細胞活性，當CD4+或CD8+細胞上存在PD-1時，甲狀腺濾泡上皮細胞的活性仍顯著高于不存在PD-1的情況(圖3)。

圖3 PD-1+T淋巴細胞促進甲狀腺濾泡上皮細胞增殖A.CCK-8法檢測細胞活性；B.凋亡率；與CD4+PD-1++CD8+PD-1+組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000;與CD4+PD-1-+CD8+PD-1-組比較，#P<0.05，##P<0.01

4.PD-1+T淋巴細胞對共培養甲狀腺濾泡上皮細胞炎性因子表達的影響：與CD4+PD-1+/-+CD8+PD-1+T淋巴細胞共培養，采用電化學發光免疫法檢測甲狀腺濾泡上皮細胞與CD4+PD-1+/-、CD8+PD-1+T淋巴細胞共培養后的IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的表達水平最高。當兩者都不存在PD-1時，共培養的甲狀腺濾泡上皮細胞中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的表達水平最低(圖4)。

討 論

GD是一種自身免疫性甲狀腺疾病，造成GD的因素較多，目前公認的包括遺傳、飲食、精神、感染與炎癥等[11]。但無論這些因素如何，其直接機制均在于體內具有不同功能的免疫細胞之間比例失衡進而導致的免疫功能異常。本研究檢測到的GD患者干擾素-γ、IL-4、IL-17和轉化生長因子-β水平的升高，也再次驗證了GD與炎性反應之間的對應關系[12，13]。據相關報道，在非肥胖小鼠中，活化的T細胞可能會分泌更多的促炎細胞因子，從而導致糖尿病的快速進展[14]。

程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)是一種負性共刺激分子，在很多疾病的發展過程中都發揮著重大作用。PD-1可以在人類的T細胞、B細胞、樹突狀細胞、活化的單核細胞和自然殺傷T細胞上表達。在胸腺、骨髓、脾等淋巴組織可低水平表達，通常PD-1只在活化的T細胞中表達。PD-1抑制劑是近年來在抗腫瘤領域最大的突破，PD-1抑制劑在具有抗腫瘤作用的同時，也介導T細胞產生了抗甲狀腺作用，與免疫性不良事件存在相關性[15]。進一步表明了PD-1/PD-L1相關的免疫機制在甲狀腺功能中的重要性。PD-1作為調控淋巴細胞功能以及多種淋巴細胞間穩態平衡的分子機制，本研究在細胞分選的基礎上，對甲狀腺濾泡上皮細胞進行共培養，對照觀察不同比例的CD4+PD-1+細胞和CD8+PD-1+細胞對甲狀腺細胞增殖、凋亡水平的影響，進一步挖掘PD-1對甲狀腺細胞的作用與影響機制。

本研究發現，GD患者CD4+T細胞百分率升高，CD8+T細胞水平降低，兩種T細胞上PD-1表達均呈上調趨勢。由于PD-1屬于CD28家族中起重要的抑制作用并維持淋巴細胞穩態的一類分子，因此如若PD-1表達發生變化，則可能影響各類淋巴細胞間的平衡，甚至整個免疫系統的功能。研究表明，正常情況下，當T細胞受體結合率較高時，PD-1才發揮削弱T細胞應答的作用[16]。若PD-1/PD-L1通路被過度激活，淋巴細胞正常的免疫殺傷功能受到抑制，這就是腫瘤細胞通過“免疫逃逸”進而惡性增殖的關鍵機制。PD-1的表達與腫瘤的發生和預后密切相關，與B細胞淋巴瘤一樣，高水平的PD-1被認為通過影響腫瘤的微環境與淋巴瘤的復發有關，PD-1/PD-L1通路的阻斷在某些方面加重了內源性抗腫瘤反應[17，18]。

在隨后的研究中，CD4+PD-1+和CD8+PD-1+T細胞與甲狀腺濾泡上皮細胞共培養，揭示了PD-1表達與甲狀腺濾泡上皮細胞之間的潛在關系。與PD-1+CD4+/CD8+T細胞共培養的甲狀腺濾泡上皮細胞，細胞存活率高，炎性因子表達水平高，提示淋巴細胞中PD-1的存在可能促進甲狀腺濾泡上皮細胞的生長、分化和炎性細胞因子的分泌水平，可能造成GD的發生和發展。PD-1和PD-1/PD-L1通路在自身免疫性疾病中的作用已被廣泛認識[7]。

目前認為GD在免疫功能失調方面的直接機制在于體內不同功能免疫細胞的失衡。在GD中，PD-1的高表達不僅在本研究中被觀察到，也被其他研究所證實，研究認為PD-1/PD-L1通路在AITD腺體中被激活，但可能沒有達到抑制疾病進展的程度[19]。此外，外周血中T淋巴細胞、B淋巴細胞的異常分布在GD患者自身免疫的發生、發展中起著重要作用。

綜上所述，本研究證實了淋巴細胞膜上PD-1在影響甲狀腺濾泡上皮細胞增殖及炎性細胞因子的變化中的作用。GD患者PD-1高表達，CD4+T細胞水平升高，CD8+T細胞水平降低。此外，淋巴細胞中PD-1的存在可能通過促進甲狀腺濾泡上皮細胞活性，炎性細胞因子水平升高，可能進一步加速GD的發生和發展。