太行雞VIPR-1基因表達特點及其功能分析

周祖陽，張輝，張清陽，白瑩，楊俊琦，劉薦男，李凱揚，劉玉芳*

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056001；2.河北工程大學園林與生態工程學院，河北 邯鄲 056001；3.北京市畜牧總站，北京 100107)

地方雞品種與商業化蛋雞品種相比，盡管雞蛋具有蛋黃顏色深、口感好等特點，但因其產蛋量低而嚴重制約了地方雞品種的推廣和發展[1]。蛋雞的產蛋性能受到多個基因的調控，查閱前人研究發現，血管活性腸肽受體-1(vasoactive intestinal peptide receptor-1，VIPR-1)是VIP蛋白受體家族成員之一，屬于Ⅱ類亞家族。有文獻報道，VIPR-1基因在下丘腦和垂體中均有表達，但主要在垂體中表達，并且只有垂體中VIPR-1基因的mRNA差異表達與生殖功能改變相關，VIPR-1基因已被證實參與禽類的育雛調節[2]。與其他家族成員結構相似，VIPR-1是一種糖蛋白，具有大的親水性細胞外N端和7個高度保守的疏水性跨膜螺旋以及細胞質C端[3]。辛清武等[4-5]研究發現VIPR-1基因C902T突變和A988G突變與黑番鴨的就巢性狀顯著相關，能夠一定程度上提高黑番鴨的產蛋性能。在雌性鵪鶉的研究中發現，VIPR-1基因的G373T和A313G兩個突變位點可用于選擇產蛋量高或蛋重大的鵪鶉品系，此外，VIPR-1基因還可以作為分子標記輔助鵪鶉生長性狀選擇的遺傳標記[6]。在寧都三黃雞的研究中也發現，VIPR-1基因中的C1704887T和C175301T兩個突變位點可能是家禽高產蛋量的重要分子標記[7]。位于VIPR-1基因內含子6的C1704887T與雞300日齡的產蛋數有顯著相關，基于VIPR-1基因C1704887T和C175301T的單倍型分析也證實了這一結果[8]。另一研究分析了VIPR-1基因的突變位點A1661691G與蛋雞初產日齡相關[9]。這些研究表明，VIPR-1基因的分子生物學功能與家禽產蛋性狀密切相關，而太行雞VIPR-1基因與產蛋性能的研究較少。

本研究選擇高產組和低產組太行雞卵巢組織作為研究對象，經過PCR擴增、克隆VIPR-1基因序列并進行測序和結構分析，利用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR技術探討VIPR-1在太行雞260日齡產蛋階段的表達情況，為后期進一步探究VIPR-1基因的分子生物學功能及深入研究VIPR-1基因與蛋雞產蛋性能的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取260日齡健康、產蛋穩定、羽色良好、體重相近的太行雞母雞250只進行標號，從蛋雞開產日開始，每日下午3時記錄每只母雞的產蛋情況，統計產蛋雞260日齡內的產蛋量，將雞群分為高產(H)(產蛋量≥40枚，平均產蛋量(48.33±0.40)枚)和低產(L)(產蛋量<40枚，平均產蛋量(28.12±0.40)枚兩組，隨后進行翅靜脈采集血液樣本并注明標號，-20 ℃保存。從高、低產蛋組中選取體態均勻、健康母雞各10只，屠宰后快速采集心、肝、脾、肺、腎、卵巢組織等樣品，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 太行雞血樣DNA提取

取20 μL血樣，使用血液DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)進行DNA提取。取出2 μL DNA與上樣Buffer混勻，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。利用NanoDrop 2 000檢測DNA的濃度，隨后放入低溫-20 ℃保存。

1.2.2 各組織RNA提取與cDNA合成

分別取約100 mg 心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和卵巢組織，按照RNA提取試劑盒說明書進行總RNA提取，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳和RNA濃度檢測。檢測合格的RNA樣品，根據Fast Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京天根生物科技有限公司)說明書將太行雞各組織RNA反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.3 太行雞VIPR-1基因克隆、擴增與測序

在GenBank數據庫中找到雞參考基因組中VIPR-1基因的CDS區序列(GenBank登錄號：NM_001097523.1)，利用Primer premier 5軟件設計目的基因(VIPR-1-E1、VIPR-1-E2、VIPR-1-E3、VIPR-1-E4、VIPR-1-E5-6、VIPR-1-E7-8、VIPR-1-E9、VIPR-1-E10、VIPR-1-E11、VIPR-1-E12、VIPR-1-E13)的CDS區引物，引物信息見表1。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應體系20 μL：2×TaqPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度見下表30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程股份有限公司進行測序。

表1 擴增VIPR-1基因CDS區及實時熒光定量PCR引物

1.2.4 太行雞VIPR-1序列結構分析

測得VIPR-1基因CDS區結果利用 NCBI 網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上BLASTP軟件進行同源基因的氨基酸序列搜索；開放閱讀框(open reading frame,ORF)氨基酸序列分析用NCBI中的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)工具完成。利用ExPASy網站(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)分析蛋白的理化性質包括相對分子質量、等電點、消光系數、親水性和疏水性、氨基酸組成等；SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白質的二級結構。

1.2.5 系統進化分析

將獲得的序列在DNAMAN 5.0軟件上進行分析，并與GenBank上獲取的其它物種序列進行同源性比較。利用 MEGA X軟件以距離矩陣鄰近歸并法(NeighborJoining，NJ)建種間系統發生樹，通過 bootstrap 法獲得系統分支的置信度(重復次數為1 000)。

1.2.6VIPR-1組織表達譜分析

以心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢組織的cDNA為模板，VIPR-1-Q1-F/R(見表1)為引物，GAPDH為內參基因進行半定量RT-PCR。PCR反應體系為20 μL：2×TaqPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共31個循環，72 ℃延伸7 min。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析半定量RT-PCR結果。

1.2.7 實時熒光定量PCR分析

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以高、低產太行雞卵巢組織cDNA為模板(每組10只)，VIPR-1-Q1-F/R(見表1)為引物，GAPDH為內參基因，采用SYBR Green Ⅰ染料法，進行實時熒光定量PCR，對VIPR-1基因在太行雞高、低產蛋量個體卵巢組織中的表達情況進行分析。反應體系：Real MasterMix(SYBR Green I)10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，利用SPSS 18.0統計軟件的t檢驗進行顯著性差異分析。

2 結果

2.1 太行雞VIPR-1基因PCR擴增

DNA提取后，經核酸檢測儀檢測和瓊脂糖電泳合格后，進行PCR擴增。用VIPR-1-E1、VIPR-1-E2、VIPR-1-E3、VIPR-1-E4、VIPR-1-E5-6、VIPR-1-E7-8、VIPR-1-E9、VIPR-1-E10、VIPR-1-E11、VIPR-1-E12和VIPR-1-E13共11對引物進行PCR擴增(每對引物4個梯度)，將產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進電泳，分別可見目的片段大小的特異性條帶(圖1)，隨后送去測序，獲得序列進行比對拼接，用于后續基因結構分析。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 太行雞VIPR-1基因序列分析

克隆測序后獲得5 942 bp全長的太行雞VIPR-1基因cDNA序列，此序列包含了長度為1 341 bp的ORF(開放閱讀框)，編碼446個氨基酸。將該序列與參考基因組的VIPR-1基因完整CDS序列進行同源性比較，發現其同源性為100%，推定該序列即為太行雞VIPR-1基因的完整CDS序列。

M.DL5000 DNA marker；a.泳道1～4、5～8、9～12、13～16分別代表VIPR-1-E1、VIPR-1-E2、VIPR-1-E3、VIPR-1-E4在4個梯度下的PCR產物電泳；b.泳道1～4代表VIPR-1-E5-6在4個梯度下的PCR產物電泳；c.泳道1～4、5～8、9～12、13～16、17～20、21～24分別代表VIPR-1-E7-8、VIPR-1-E9、VIPR-1-E10、VIPR-1-E11、VIPR-1-E12和VIPR-1-E13在4個梯度下的PCR產物電泳圖1 VIPR-1基因梯度PCR產物電泳

2.2.2 分子進化分析

用DNAMAN 5.0 軟件進行同源性比較分析，太行雞VIPR-1基因編碼區序列和其他已經報道的禽類VIPR-1基因的同源性較高，其中與野鴨(XM_005023238)的同源性最高為 92.24%；其次為火雞(U31991)90.11%；與綿羊(XM_027958056)、豬(NM_214036)、牛(NM_001081607)、人(NM_004624)、小鼠(NM_011703)、兔(XM_002713061)、非洲爪蟾(XM_002941864)、沼澤蛙(AF100644)等哺乳物種、兩棲類的同源性較低，在64.51%～67.18%。氨基酸序列比較發現，太行雞的VIPR-1氨基酸序列與野鴨氨基酸一致性高達93.72%，與火雞的一致性也達到82.93%，與人、犬、牛、豬等哺乳物種的同源性在62.95%～65.50%，與非洲爪蟾、兩棲類沼澤蛙的同源性比其他哺乳物種高，分別為74.22%和76.34%。見表2。

表2 VIPR-1不同物種間同源性比較

2.2.3 N-J系統進化樹

圖2 太行雞VIPR-1基因系統發生樹

2.2.4 太行雞VIPR-1蛋白結構預測

利用ORF Finder預測太行雞VIPR-1基因編碼446個氨基酸。太行雞VIPR-1蛋白特征分析顯示，該蛋白分子質量為112 620.03 Da，理論等電點為4.98，280 nm的摩爾消光系數為172 375 moL中含量-1；該蛋白質包含了20 種常見的氨基酸，其氨基酸含量中色氨酸最低為1.9%，亮氨酸和絲氨酸含量高分別為10.9%和10.6%，其他氨基酸的含量在2.0～8.0之間，酸性氨基酸和堿性氨基酸含量較低，分別為7.1%和16.6%，帶電荷的氨基酸和疏水氨基酸的含量分別為21%和36%；精氨酸(Arg)疏水性最強(最高分值為4.5)，異亮氨酸(Ile)親水性最強(最低分值為-4.5)；疏水性預測顯示太行雞 VIPR-1大多數氨基酸為親水性氨基酸，總平均疏水性為-0.250(圖3)。蛋白質二級結構分析發現太行雞VIPR-1蛋白由α-螺旋、延伸、β-旋折疊及無規則卷曲4種結構組成，所占比例分別為30.1%、21.12%、7.85%和40.94%。

圖3 太行雞VIPR-1蛋白疏水性分析

2.3 組織半定量RT-PCR表達譜分析

VIPR-1基因在太行雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和卵巢中均表達，但在卵巢中表達量最高(圖4)。

1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺臟；5.腎臟；6.卵巢圖4 VIPR-1基因在太行雞各組織中表達

2.4 熒光定量PCR分析卵巢中VIPR-1基因表達水平

VIPR-1基因在高產母雞和低產母雞卵巢中相對表達量見圖5。熒光定量PCR結果顯示，VIPR-1基因在高產太行雞卵巢組織中的表達量顯著高于低產蛋雞中的表達量(P<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)；H.太行雞高產組；L.太行雞低產組圖5 VIPR-1基因在太行雞高產和低產母雞卵巢中的表達量

3 討論

太行雞又稱河北柴雞，主要分布于河北省境內太行山區及周邊地區，中心產區為沙河、贊皇、淶源等地，以產蛋為主，兼作肉用。太行雞具有體型小、耐粗飼、抗逆性強、適應性強、覓食力強、蛋肉品質好，營養價值高等優點，但該地方雞品種同時也存在著產蛋期產蛋量低的缺點[10]。本研究分析了對太行雞血液中VIPR-1基因編碼區的結構特征，進一步對不同物種的VIPR-1基因CDS序列及氨基酸序列進行同源性比較，利用定量和半定量PCR技術對VIPR-1基因在太行雞中的表達模式進行研究，為深入探究VIPR-1基因的功能奠定了基礎。

近年來，大量研究對禽類VIPR-1基因進行了研究，發現了VIPR-1基因在不同繁殖時期mRNA的表達量不同，證明了VIPR-1基因對產蛋性能有一定影響[11-12]。在洪軍等[13]的研究中，以如皋黃雞為素材，發現VIPR-1基因內含子2的2個多態位點與如皋黃雞產蛋性能和蛋品質之間的關系，發現VIPR-1基因對如皋黃雞的產蛋性能和雞蛋品質有一定影響。目前，在家禽的研究中，雞、黑番鴨、鵪鶉等物種的VIPR-1基因CDS序列已被克隆[2,4,6]，然而在太行雞中對于該基因的研究目前少有報道，本試驗獲得了太行雞VIPR-1基因CDS全長，并對該基因的核酸序列和蛋白序列的分子特性進行了分析，發現太行雞與野鴨VIPR-1基因一致性高達92.24%，其次是火雞90.11%，表明該基因的功能在禽類中具有一定的保守性，推測其在功能上可能也具有一致性。

前人研究發現，VIPR-1基因在家禽馴化和飼養期間的改良中經受了較強的選擇壓力，其DNA序列突變與雞的繁殖有關[14]。VIPR-1基因在家禽行為中起著重要的作用，VIPR-1基因的mRNA表達在不同的時期不盡相同[15]。Karacay等[16]研究發現，VIPR-1基因主要是通過與VIP蛋白特異性結合，調節PRL合成與分泌，進而影響畜禽的繁殖性能。朱志明等[17]研究發現VIPR-1基因的多個多態位點對蛋雞產蛋性狀存在顯著影響，可以作為影響產蛋性狀的重要分子標記。本試驗發現VIPR-1基因在不同的組織均有表達，在卵巢組織中表達量最高；進一步發現VIPR-1基因在太行雞高產組卵巢組織中的表達量顯著高于低產組，該結論驗證了前人結果，同時也表明該基因能夠影響太行雞的產蛋性能。

4 結論

太行雞VIPR-1基因作為影響蛋雞產蛋性能的重要候選基因，在其他家禽如火雞、野鴨中具有較高的相似性；該基因在卵巢組織中高表達且在高產組中的表達量顯著高于低產組，因此，該基因轉錄水平上的差異與太行雞產蛋性能密切相關。本研究為進一步探究VIPR-1基因的分子作用機制和在太行雞產蛋性能中的調控作用提供了依據，為后期深入研究蛋雞產蛋性能的分子生物學機理奠定基礎。