鈣對氟中毒大鼠腎臟損傷和凋亡的影響

范俊江，王金明

(山西農業大學 動物醫學學院，山西 晉中 030801)

氟是一種非常活潑的鹵族元素，化學性質非常穩定，分布于自然界和人類生活的方方面面[1]。人們通常會通過飲水和食物攝入氟，當攝入氟的量超過機體的正常體內蓄積時，會出現“氟中毒”現象[2〗。氟中毒病不僅對人類的健康造成非常大的威脅，并且每年可對農業畜牧業造成數以萬計的經濟損失，嚴重影響了社會的健康進步和農業的綠色可持續發展。

近年來氟中毒的研究中報道了高氟暴露下機體組織器官的損傷，例如腦、睪丸、脾臟、肝臟、腎臟等[3]。其中腎臟普遍被認為是機體進行排氟最重要的器官，腎小球對氟具有很強的濾過作用，生物體內70%以上的的氟均由腎臟進行過濾和排出，同時大量的氟蓄積也會導致腎臟的組織結構和功能發生惡化[4]。

氟中毒還導致組織器官凋亡現象的發生[5]。在細胞的凋亡進程中，Caspase8蛋白和Caspase3蛋白是凋亡現象發生最為明顯的特異分子[6]。細胞膜表面有大量的凋亡相關受體蛋白，可被激活參與細胞凋亡信號的發生和傳遞，其中Fas凋亡蛋白尤為重要，它屬于腫瘤壞死家族，作為一種關鍵的跨膜蛋白，被激活后可以與其配體Fas-L進行相關特異性結合，最終活化Caspase家族凋亡蛋白，導致凋亡現象的發生[7]。

鈣被認為是對治療氟中毒最好途徑之一，在氟中毒疾病高發地區，鈣已經被廣泛作為一種膳食添加物來對氟中毒等疾病進行預防[8]。鈣在調節激素分泌、調節血壓、控制機體排毒能力等發揮著不可忽視的作用。但是鈣對氟中毒機體腎臟損傷的治療效果和作用機制仍屬未知。因此，試驗建立氟中毒加鈣的大鼠模型，飼喂0.5%鈣濃度和1%鈣濃度的飼料，檢測腎臟相關的功能指標、腎結構形態變化，檢測腎臟中凋亡蛋白的表達，為在生產實踐過程中使用營養物質鈣治療氟中毒提出可靠的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用體重大小均為120±10 g，28日齡的健康雄性SD大鼠120只，均購買自山西醫科大學實驗動物中心。

1.2 試驗模型設計

首先將大鼠進行一周的適應環境飼養，之后隨機分為4組，每組30只，分別為對照組、氟組(100 mg·L-1F-)、氟 + 0.5% 鈣組(F-+ 0.5% Ca)、氟 + 1% 鈣組(F-+ 1% Ca)，分組如表1所示。飼養期間所有大鼠均采用自由采食和自由飲水的條件進行飼養，保持合適的溫度和濕度，保證飼養環境的干凈和安靜。

表1 大鼠模型的建立

1.3 主要儀器和試劑

氟化鈉、碳酸鈣、氯化鈉、乙醇、甲醛、二甲苯、HE染色試劑盒、中性樹膠等試劑(購自北京索萊寶公司)；高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；WFJ 2100型可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；數顯電熱恒溫水浴箱(北京市長風儀器儀表公司)；Y 9600 型電子分析天平(上海精密科儀器公司)；-80℃超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)；血清肌酐(CRE)、尿酸(UA)檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白抗體和濃縮型DAB試劑盒(購自北京博奧森生物技術有限公司)。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 一般癥狀觀察 試驗周期內每天對大鼠的飲食、飲水、毛發、排泄物、精神狀態等進行觀察，并且詳細記錄。

1.4.2 生化指標測定 分別于不同試驗周期30 d、60 d、90 d，每組大鼠中隨機挑選10只大鼠，采用眼球采血的方式采取血液，一部分血液進行尿素氮(BUN)的測定，另一部分血液以3 000 r·min-1的條件低溫速度離心10 min獲得血清，進行肌酐(CRE)和尿酸(BUN)的測定，所有指標均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒指導進行檢測。

1.4.3 腎臟切片HE染色觀察 試驗90 d時，每組隨機挑選5個腎臟組織，固定在10%福爾馬林48 h，之后進行流水沖洗，切取合適大小的塊狀，根據HE染色試劑盒的說明進行石蠟包埋，石蠟切片，HE染色和封片，使用顯微鏡對切片進行觀察和分析。

1.4.4 腎臟組織凋亡蛋白的檢測 試驗90 d時，每組隨機挑選5個腎臟組織，放在10甲醛溶液進行固定48 h，流水沖洗后切取合適大小的組織進行常規乙醇脫水，石蠟包埋，石蠟切片，切片大小為4 μm，然后采用ASBC法對腎臟組織Fas、Fas-L、Caspase8和Caspase3蛋白進行化學染色，使用DAB顯色法對切片進行顯色，然后運用顯微鏡在同一條件下獲取各個組中腎臟樣本的試驗圖像，運用分析軟件Image-Pro plus v.5.0 進行平均光密度分析，每個樣本選取10張切片，每個切片隨機挑選8個視野，分析每個視野中陽性區域面積的平光光密度值，然后進行差異顯著性顯著檢驗。

1.5 數據分析

數據用“均數±標準差( ±)”表示，采用LSD進行顯著性檢驗，使用SPSS 23.0進行數據的分析與處理，P< 0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 大鼠生長狀態

對照組大鼠生長正常，牙齒和毛發無異常，精神狀態正常，尿液清亮，糞便顏色和質地正常；氟組大鼠生長正常，精神和運動正常，牙齒有白堊現象，尿液和糞便顏色均正常；氟加低鈣組大鼠在飼養末期生長緩慢，運動正常，但會出現嗜睡現象，毛發雜亂，尿液較少，糞便顏色出現淡灰白色；氟加高鈣組大鼠生長緩慢，不喜飲水，進食減少，運動減少，毛色無光澤，且尿液量極少，出現渾濁，糞便質地較硬，呈灰白色。

2.2 腎臟相關生化指標

如表2所示，30 d時，各組指標變化不顯著。60 d時，與對照組相比，BUN、CRE、UA水平升高(P< 0.05)；與氟組相比，氟 + 1% 鈣組中BUN水平降低，CRE和UA水平顯著降低(P< 0.05)。90 d時，與對照組相比，腎臟損傷嚴重，氟組BUN、CRE、UA水平顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)；與氟組相比，氟加鈣組損傷均有一定的緩解，氟 + 0.5% 鈣組和氟 + 1% 鈣組中BUN、CRE、UA水平均發生顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)

2.3 腎臟HE染色

從圖1中可以看出，對照組腎臟結構正常，腎小球充盈且間隙均勻；氟組大鼠腎臟結構結構發生明顯改變，腎小球發生萎縮，間隙增大，細胞排列紊亂，腎細胞結構受損；氟 + 0.5 % 鈣組中雖然有一定程度的好轉，但是腎臟結構損害現象依然很明顯；在氟 + 1 % 鈣組中，腎小球形態逐漸恢復正常，腎細胞排列逐漸規整，細胞間隙減小，腎臟的形態結構有很明顯的改善。

表2 不同周期大鼠腎臟相關指標變化

2.4 腎臟相關凋亡蛋白免疫組化

腎臟中凋亡蛋白Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3的表達如圖2所示。從表3的分析結果可以得出，與對照組相比，氟組腎細胞凋亡增強，Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表達均發生顯著增強(P< 0.05，P< 0.01)；與氟組相比，在氟 + 0.5% 鈣組和氟 + 1% 鈣組中，以上蛋白的表達均顯著性降低(P< 0.05，P< 0.01)，腎細胞凋亡程度降低。

表3 腎臟中Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表達統計結果

3 討論與結論

氟中毒的危害已經蔓延全球，且具有難以治愈、被侵害器官多、機體受損時間較長等特點。氟中毒的治療已經成為人們日常關注的重點，使用鈣對氟中毒進行治療引起了廣泛的關注。

腎臟具有維持內環境激素分泌、調節血壓、物質傳送等功能，一方面可以維持體內電解質和酸堿平衡，另一方面可以運輸有害物質排出體外。其中腎臟的生化功能指標和形態結構是反映腎臟是否可正常行使功能的重要方面。氟中毒高發地區人體的腎臟功能指標檢測報告稱腎小球的濾過率發生明顯惡化，尿素氮、肌酐等指標水平均發生顯著升高[9]，另有報道發現，慢性暴露于高氟環境的大鼠腎臟功能發生損害，腎小球排列紊亂，形狀不規整，且有大量的炎癥細胞浸潤，且指標尿酸、堿性磷酸酶等水平發生升高[10]。在本實驗結果中同樣發現氟中毒使得腎臟的結構遭到損害，生化功能指標BUN、CRE、UA也發生顯著升高，腎功能受損，但是在補充鈣后腎臟的結構形態逐漸恢復，細胞排列變得整齊，且生化指標BUN、CRE、UA水平發生明顯好轉，可以看出鈣可緩解由氟中毒帶來的腎臟損傷和功能下降。

細胞凋亡被稱作為細胞的程序性死亡，是細胞體內由基因控制的一種生命進程[11]。氟中毒會導致機體的多種組織器官均會發生凋亡現象， Caspase8、Caspase3蛋白表達發生明顯增強，占凋亡發生的主導地位[12]。Fas和Fas-L系統是近年來在細胞凋亡領域研究較為深入的一類分子，它也是具有促進凋亡發生的神經類生長因子受體[13]。有研究指出機體在發生氟中毒時，Fas和Fas-L在發生凋亡的睪丸細胞和牙齦成纖維細胞凋亡過程中顯著增加，同時激活Caspase8和Caspase3[14～15]。與此類似，在本實驗中，氟組大鼠的腎臟Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表達均增強，表明腎臟細胞發生了凋亡，但是在加鈣組中，它們的表達量均下降，腎細胞凋亡受到抑制，表明鈣可一定程度緩解由氟中毒導致的腎臟凋亡，體現鈣對緩解氟中毒的優勢作用。

總之，氟中毒會造成腎臟的損傷和凋亡，在補充營養物質鈣后，會很好的緩解由氟中毒導致的腎臟損傷和凋亡，其中，添加1% 鈣含量效果甚佳。