茶樹帶腋芽莖段組織培養(yǎng)研究

劉 靜

(安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000)

茶樹[Camelliasinensis(L.)O．Kuntze]屬山茶科山茶屬多年生木本植物[1]。茶葉為我國重要的飲料作物，茶葉中的茶多酚類、植物堿、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等有機(jī)化學(xué)成分和無機(jī)礦物元素具有很高的價值[2]。茶樹為異花授粉，其高度的自交不親合性、自交衰退、結(jié)實率低等因素限制了遺傳改良工作的進(jìn)行[3]。茶樹按照繁殖方式的不同分為種子繁殖和無性繁殖，種子直播簡單易行，成本低廉，但是由于茶樹容易發(fā)生性狀分離導(dǎo)致優(yōu)良性狀丟失，對茶園的長久發(fā)展帶來了很大的困難。無性繁殖以扦插為主，但是該方法在育苗周期、繁殖系數(shù)、對自然環(huán)境的要求方面有一定的缺陷，在茶樹新品種育成時，先需要經(jīng)過多年的原種擴(kuò)繁，等完成一定規(guī)模后，才能進(jìn)行大面積栽種，這使得茶樹新品種的繁育和推廣速度受到限制[4]，利用植物組織培養(yǎng)來生產(chǎn)種苗，不僅可以保持優(yōu)良性狀，縮短育種年限，實現(xiàn)快速繁殖，還可以避免環(huán)境對育種時間的限制，實現(xiàn)批量化、大規(guī)模生產(chǎn)。在茶樹的繁殖過程中，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對葉片、莖段、腋芽以及根等外植體進(jìn)行誘導(dǎo)來獲得完整的植株，再進(jìn)行移栽。為建立茶樹高效組織培養(yǎng)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為“陜茶一號”茶樹幼嫩枝條，由安康市雙龍鎮(zhèn)三星茶廠提供。

1.2 方法

取茶樹幼嫩枝條，切至長2 cm左右的帶芽莖段，將帶芽莖段流水沖洗2 h，在超凈工作臺中用75%的酒精消毒30 s，再用0.1%氯化汞消毒滅菌8 min，用無菌水沖洗5～6次后接種于不同培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照8～10 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

1.2.1 不同取材時間對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響 分別于4月上旬、5月上旬、6月上旬取茶樹幼嫩莖段，將消毒過的莖段接種在MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，每個月份的材料接種20瓶，每瓶接種2～3個外植體，重復(fù)三次。接種40 d后比較不同取材時間對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響，統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率。

腋芽誘導(dǎo)率(%)=(分化出腋芽的外植體數(shù)/未污染外植體總數(shù))×100%

1.2.2 外植體不同放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響 將茶樹帶腋芽莖段滅菌以后接種在MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1培養(yǎng)基上，共接種40瓶，每瓶2～3個外植體，其中20瓶培養(yǎng)基中莖段水平放置，另外20瓶培養(yǎng)基中莖段基部插入培養(yǎng)基，重復(fù)三次。觀察腋芽的生長情況，40 d以后比較莖段不同放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響，統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率。

腋芽誘導(dǎo)率(%)=(腋芽萌發(fā)的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%

1.2.3 附加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基和對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響 將消毒過的帶腋芽莖段接種到不同的培養(yǎng)基(1.MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-12.MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-13.MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-14.MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-15.1/2MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-16.1/2MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-17.1/2MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-18.1/2MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1)上。每瓶培養(yǎng)基中接種2～3個外植體，每種培養(yǎng)基接種20瓶。重復(fù)三次。接種40 d后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率，比較不同培養(yǎng)基對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響。

腋芽誘導(dǎo)率(%)=(分化出腋芽的外植體數(shù)/未污染外植體總數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取材時間誘導(dǎo)對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響

從表1中可以看出，4月上旬茶樹腋芽誘導(dǎo)率為71%，5月上旬腋芽誘導(dǎo)率為88%，6月上旬腋芽誘導(dǎo)率為77%。與4月和6月相比，5月份外植體誘導(dǎo)率較高。茶樹為多年生灌木，其最適的生長溫度為20～30℃，4月份氣溫開始回升，茶樹開始抽枝生長,處于生長初期的枝條比較幼嫩，在消毒過程中容易受到損傷，不利于腋芽的誘導(dǎo)。5月氣溫上升，雨水充沛，利于茶樹生長,茶樹枝條達(dá)到15～20 cm，節(jié)間較長較嫩，脫分化能力強(qiáng)。6月份溫度繼續(xù)升高，茶樹生長較快，枝條逐漸木質(zhì)化，脫分化能力弱，不利于茶樹腋芽誘導(dǎo)。因此,5月份的茶樹枝條更有利于腋芽誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)出腋芽所需的時間短，芽的長勢也好。

2.2 比較莖段的不同放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響

從表2可知，莖段不同的放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)率的影響不同。水平放置培養(yǎng)的莖段，腋芽的萌發(fā)率是83%，基部插入培養(yǎng)基培養(yǎng)的莖段，腋芽的萌發(fā)率是36%。從實驗結(jié)果可知，莖段水平放置培養(yǎng)，腋芽的萌發(fā)率更高，可能的原因是材料水平放置，增加了材料與培養(yǎng)基的接觸面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，材料基部插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方式，材料與培養(yǎng)基的接觸面積較少，材料吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)少且慢，導(dǎo)致腋芽生長發(fā)育緩慢。所以將材料水平放置更有利于茶樹腋芽的誘導(dǎo)。

表2 莖段的不同放置方式對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響

2.3 附加不同濃度植物激素的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響

實驗以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，在含有NAA和6-BA的培養(yǎng)基上，帶芽莖段接種一周后，莖段開始膨大(圖1A)；外植體培養(yǎng)20d后，切口有少量愈傷組織出現(xiàn)，腋芽萌發(fā)(圖1B)；培養(yǎng)40 d后，腋芽葉片開始舒展(圖1C)，接種90 d后，腋芽發(fā)育成有5～6片真葉的枝條(圖1D)。由表3可以看出：MS培養(yǎng)基中，6-BA濃度為2.0 mg·L-1，NAA濃度為0.5 mg·L-1時，誘導(dǎo)率最高，為92%。因此，在MS基本培養(yǎng)基中，腋芽誘導(dǎo)的最適激素濃度配比為：6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1.在1/2MS的培養(yǎng)基中，6-BA濃度為2.0 mg·L-1，NAA濃度為0.2 mg·L-1的誘導(dǎo)率較高，為88%。因此，當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS時，腋芽誘導(dǎo)的最適濃度配比為：6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1。

表3 不同的植物激素對腋芽誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 茶樹外植體取材時間對腋芽誘導(dǎo)的影響

目前，關(guān)于茶樹莖段組織培養(yǎng)的研究報道較少，茶樹在不同時間取材，腋芽誘導(dǎo)率有明顯差異，王樹芝[5]等研究發(fā)現(xiàn)，與8月份和10月份相比，5月份取材的外植體腋芽萌動最快,萌發(fā)率最高，10月份取材的外植體腋芽萌動最慢,萌發(fā)率最低，8月份取材的外植體的腋芽萌發(fā)時間和萌發(fā)率介于5份月和10月份之間,本次實驗研究發(fā)現(xiàn)5月份莖段腋芽的誘導(dǎo)率明顯高于4月份和6月份。且5月份莖段腋芽誘導(dǎo)所需的時間也比4份月和6月份短，這與王樹芝等研究結(jié)果相似，綜上所述，在茶樹莖段腋芽誘導(dǎo)中，帶芽莖段的最佳取材時間為5月，在此期間取材培養(yǎng)，腋芽誘導(dǎo)率較高。

3.2 不同濃度植物激素對茶樹腋芽誘導(dǎo)的影響

研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中植物激素的種類和濃度會對外植體的分化能力產(chǎn)生影響，高濃度生長素會促進(jìn)愈傷組織的形成，而愈傷組織的形成會降低增殖率，高濃度的細(xì)胞分裂素會抑制愈傷組織的形成，但對芽的誘導(dǎo)和生長有一定的促進(jìn)作用。李家華等[6]以大葉種茶樹新梢為外植體，認(rèn)為6-BA0.5 mg·L-1+2.4-D4.0 mg·L-1促進(jìn)腋芽形成單生芽的效果最好,6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1誘導(dǎo)愈傷組織形成和腋芽分化均獲得較好效果,6-BA4.0 mg·L-1對促進(jìn)叢芽形成效果最好。袁正仿等[7]以藪北茶樹帶腋芽的莖段為外值體,認(rèn)為最佳腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg·L-1，芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1，在此次實驗中，培養(yǎng)基中添加的生長素是萘乙酸(NAA)，細(xì)胞分裂素是6-BA，通過對比附加不同植物激素的培養(yǎng)基對腋芽誘導(dǎo)的影響,我們發(fā)現(xiàn)：在MS培養(yǎng)基上，NAA和6-BA的濃度都較高時，腋芽的誘導(dǎo)率較高，說明在MS培養(yǎng)基上附加較高濃度的植物激素可以促進(jìn)腋芽的誘導(dǎo)；在1/2MS培養(yǎng)基上，NAA濃度較低和6-BA濃度較高時，腋芽的誘導(dǎo)率較高，而NAA和6-BA濃度都為高濃度時，腋芽誘導(dǎo)率明顯下降，說明在1/2MS培養(yǎng)基上，腋芽誘導(dǎo)所需的植物激素有一個最適濃度，超過這個濃度范圍，腋芽誘導(dǎo)率會明顯降低。以1/2MS為基本培養(yǎng)基的四種培養(yǎng)基的平均腋芽誘導(dǎo)率要稍優(yōu)于以MS為基本培養(yǎng)基的平均腋芽誘導(dǎo)率。