制備天麻染色體有絲分裂中期標本的組織篩選

楊通靜，王 沁

（貴州省農作物品種資源研究所,貴州貴陽 550006）

天麻是具有內生菌根的蘭科植物。它的植物體沒有根與綠葉，種子萌發后，主要依靠分解侵入其體內的蜜環菌菌絲生活[1]。因此，天麻的有絲分裂標本制作不能像其他植物那樣選用根、葉等組織結構制備[2-4]。1984年梁漢興[5]以花粉小孢子觀察了原天麻染色體單倍體數目。2010年王德信[6]也以花粉小孢子為材料，觀察減數分裂過程中的細胞學特征。鑒定出天麻單倍體的染色體數目為18，但天麻染色體特征不能較好的呈現，也無法鑒定天麻的染色體倍數。為了有效觀察天麻染色體特征和鑒定其倍性，筆者擬從天麻不同組織、不同時間取樣制片，篩選出最佳取材部位，用于觀察天麻染色體有絲分裂中期的結構特征。

1 材料與方法

1.1 材料

品種：純化4代以上的紅稈天麻。培育地點：天麻種質資源圃。種質來源：貴州省農作物品種資源研究所真菌室課題組。

1.2 方法

1.2.1 材料培養方法

（1）天麻花柱頭培養

將成熟天麻（鸚哥嘴完整無損傷）塊莖埋于濕度在40%左右沙土中，置于22-25oC，相對濕度60%的環境下，讓其抽薹。

（2）花粉帽培養

將成熟天麻（鸚哥嘴完整無損傷）塊莖埋于濕度在40%左右沙土中，置于22-25oC，相對濕度60%的環境下，讓其抽薹。

（3）原球莖培養

將剛采摘（每年的5-7月）的成熟的天麻種子與萌發菌進行拌種，置于培養好的固定菌床中覆土培養，自然條件下萌發，取不同大小的原球莖在不同時間段進行觀察比較。

（4）初生莖

成熟天麻塊莖的鸚哥嘴人為掰斷后，將其塊莖埋于濕度在40%左右沙土中，自然條件下生長，在不同時間取不同塊莖大小制片觀察。

1.2.2 標本制備方法

制片基本流程：取材——預處理——固定——解離——清洗——染色——壓片——鏡檢。

1.3 制片

取材：1）柱頭：分別在不同開花期和同一天不同時間段取柱頭；2）花粉帽：分別在不同開花期和同一天不同時間段取材；3）原球莖：分別在不同發育期和不同時間段取原球莖；4）初生塊莖：分別在不同發育期和不同時間段取初生塊莖。

預處理：將材料置于0.002%-0.004%/L 8-羥基喹啉中，室溫處理50min左右，取出用蒸餾水漂洗2-3次。

固定：然后用新配的卡諾固定液進行固定，時間為1h。

酸解：將清洗好的材料取下柱頭，因為天麻花的柱頭異于其他花，取時輕用鑷子進行提取，置于1M鹽酸中60oC條件下酸解5min。

清洗：吸去酸解液，用蒸餾水輕輕洗2-3次。

染色：將固定后的材料（組培材料取莖尖0.2cm）置于干凈載玻片上，加改良后的卡寶品紅染液1-2滴，染色50min。

制片：用45%的冰醋酸洗1-2次，取干凈的蓋玻片蓋在材料上，先用鉛筆頭或者鑷子輕輕敲打，再用拇指壓片。

鏡檢：制備好后的標本在顯微鏡下觀察，對有絲分裂相好的細胞進行觀察、拍照。

1.3.1 分裂中期細胞計數方法

分別在10×10倍和10×100倍顯微鏡下觀察、統計單張標本中處于有絲分裂中期細胞總數。每個組織同時制備3份染色體標本進行鏡檢，計算平均數。

1.3.2 制備染色體有絲分裂標本的組織及時間段優劣比較

通過比較不同時間段、不同組織制備的標本中處于染色體有絲分裂中期的細胞數量越多，說明越利于制片觀察。

2 結果與分析

2.1 不同組織部位制備天麻有絲分裂標本觀察對比結果

表1、表2及圖1、2的結果表明，天麻花粉帽在自然情況下，開花前5天花粉帽分裂處于高峰期，每天的 9：00-11：00處于有絲分裂中、后期的細胞較多，但是，總體數量相對較少。天麻花柱頭在自然情況下，開花前5天的上午9：00-11：00處于中期分裂相的細胞較多，單張制片中處于有絲分裂中期細胞數相對較多。

表3、表4 及圖3、4 的結果表明，自然狀態下，原球莖、天麻初生莖的細胞活躍期較為集中在10：00-12：00期間，此時，處于染色體有絲分裂中期的細胞數量相對較多，但是，在下午13：00-14：00間，也能觀察到處于有絲分裂中期的細胞存在，但是相對較少。

表2 不同開花期柱頭及不同時間處于染色體分裂中期細胞數統計表

表3 原球莖不同時期不同時間處于染色體分裂中期細胞數多少比較表

表4 天麻初生莖不同時期不同時間處于染色體分裂中期細胞數多少比較

圖1 不同開花期花粉帽在不同時間段處于染色體分裂中期細胞數分布圖

圖2 不同開花期柱頭及不同時間處于染色體分裂中期細胞數分布圖

圖3 原球莖不同時期不同時間處于染色體分裂中期細胞數分布圖

圖4 天麻初生莖不同時期不同時間處于染色體分裂中期細胞數多少比較

2.2 天麻不同組織部位制備的標本難以程度結果

表5結果表明，四種組織中，花粉帽、原球莖和初生莖細胞壁難以解離，細胞不易分散，壓片難度大。柱頭制片各環節都較為容易，鏡檢結果較好。

表5 天麻不同取材部位制片難易程度比較

3 結論與分析

1）用天麻柱頭制備染色體有絲分裂標本最佳。天麻初生塊莖和次生塊莖中活躍的細胞數量大大增加。但是，制片難度大，可能與細胞壁纖維化程度大有關系，且細胞活躍期分布不是太明顯可能是與由于土壤溫度回升較慢所致。

2）天麻開花當天至開花前5天，上午9：00-11：00，柱頭細胞分裂處于活躍期，且柱頭組織比較軟，有利于染色體標本的制備。天麻開花后隨著時間的推移，其柱頭表面黏性逐漸減弱，組織結構逐漸變硬，導致制備染色體有絲分裂中期標本過程中解離難度增加，開花3天后的柱頭很難獲得分散較好的細胞標本。這可能是柱頭暴露在空氣中后，水分揮發導致其組織結構收縮變硬，同時制片過程中沒有促使細胞膜擴張處理所致。

3）花粉帽、原球莖、初生莖雖然在不同的時間段有少數細胞可以觀察到處于有絲分裂中期的細胞，這可能與細胞活躍程度直接相關。且解離難度較大，背景色腳深，很難找到較為理想的染色體有絲分裂中期圖片，細胞壁纖維化程度增加以及細胞內含物質增加相關。