天麻染色體有絲分裂期標本的制備方法

楊通靜，桂 陽，黃萬兵，朱國勝

（貴州省農作物品種資源研究所,貴州貴陽 550006）

我國栽培的天麻主要有紅天麻、烏天麻、綠天麻，均為天麻變種[1]。天麻的研究主要集中在分類[1]、栽培[2]、化學成分[3-4]、藥效[5-6]等方面。染色體是生物細胞核中最重要而穩定的成分，它具有特定的形態結構和一定的數目，具有自我復制能力，并積極參與細胞的代謝活動，是決定物種繁衍的遺傳物質的載體。天麻遺傳學方面的研究較少，梁漢興[7]、王德信[8]等以花粉小孢子為材料，觀察減數分裂不同時期染色體特征，鑒定出天麻單倍體的染色體數目，但天麻有絲分裂染色體特征不能較好的呈現，也無法鑒定天麻的倍性。植物染色體制片和核型分析技術是細胞遺傳學中最基本、最常用的方法，在物種親緣關系鑒定、染色體變異、雜種分析等方面得到廣泛應用。其中，去壁、低滲法是植物染色體制片和核型分析技術最為常用的方法，在染色體計數、組型分析、Giemsa分帶、掃描電鏡觀察染色體方面均得到大量的應用[9]。其主要特點在于利用纖維素酶、果膠酶混合液對細胞壁進行分解后，增加低滲環節，使細胞膜在低滲條件下擴張的同時，促使染色體更加分散。但是，天麻的細胞內存在大量的內涵物質，特別是塊莖材料中存在大量的淀粉，為了有效觀察天麻染色體特征，以及前期的工作，筆者擬利用天麻柱頭結合低滲制片法，通過增加低滲環節，使解離后的細胞在低滲透壓下充分擴張，使染色體充分分散，建立一種天麻染色體有絲分裂中期的制片方法，以期觀察天麻染色體結構特征。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為純化4代以上的烏天麻，源于貴州省農作物品種資源研究所真菌室課題組。

1.2 方法

1.2.1 材料培養方法

將箭麻（鸚哥嘴完整無損傷）塊莖埋于濕度在40%-50%沙土中，讓其自然狀態下抽薹，開花當天及開花前5天的天麻花柱頭。

1.2.2 染色劑的配制

吉姆薩（Giemsa）染色試劑的配制 吉姆薩0.6g，甘油 50ml，甲醇100ml；將吉姆薩染粉溶于甘油內，在研缽內研磨3-4h，使之磨勻，加入純甲醇后攪拌均勻，放入深棕色瓶內，室溫下保存，2周后即可使用。

改良石炭酸品紅染色劑的配制 1）原液A：稱取3g堿性品紅（Basicfuchsin）溶于100ml 70%乙醇中（可永久保存）；2）原液B：取10ml 原液A加入90m15%的苯酚水溶液，在37 ℃條件下溫育2-4h（該溶液不穩定，應在2周內使用）；3）原液C：取55ml原液B加入6ml 冰乙酸和6ml 甲醛，充分混勻；4）卡寶品紅染液：取10-20ml 原液C加入約80ml 45%的冰乙酸和1g山梨醇（可永久保存）。

1.2.3 鏡檢

選取分散良好、染色體完整、邊緣清晰的染色體不同分裂相，在10 x 100倍鏡下觀察染色形態結構，顯微照相。

2 標本制備方法的篩選

2.1 紡錘絲阻斷劑的選擇

通過對常用的紡錘絲阻斷劑秋水仙素和8-羥基喹啉在不同濃度和處理時間進行篩選，見表1及表2。8-羥基喹啉1h處理后的圖片見圖1。

表1 秋水仙素不同時間染色體有絲分裂中期細胞數多少對比表

表2 8-羥基喹啉不同時間染色體有絲分裂中期細胞數多少對比表

2.2 解離試劑的篩選

天麻制片過程中，解離尤為重要，是制片的關鍵，解離效果不好，細胞軟化不夠，天麻組織擠壓不開，細胞分散不開和重疊，染色體分散不開，不易觀察染色體數目和特征。通過對混合酶（纖維素酶、果膠酶）在28oC恒溫處理，HCL60oC恒溫處理不同時間對比，見表3及表4。HCL 60oC解離5min處理圖片見圖2，探索最佳處理方法。

表3 不同濃度的混合酶不同時間處理效果對比表

表4 不同濃度的HCL不同時間處理效果對比表

2.3 染色劑的選擇和染色時間的確定

染色體制片過程中，染色體著色深淺是制片的關鍵，通過對吉姆薩（Giemsa）染色試劑和改良石炭酸品紅通用濃度下不同時間染色觀察，篩選最佳染色時間，見表5。不同染色劑染色效果圖片見圖3。

圖1 8-羥基喹啉1h處理后的圖片

圖2 1.0M HCL 60oC解離5min處理圖

圖3 不同染色劑染色效果圖

表5 不同染色效果比較

3 結果

3.1 阻斷劑篩選

在試劑篩選過程中，發現濃度在0.002%-0.004%的8-羥基喹啉（8-Hydroxyquinoline）處理50min效果較佳，處于細胞中期的染色體濃縮度大，易于觀察。天麻染色體標本制備過程中，秋水仙素在1.5h后其阻斷效果較好。

3.2 解離劑篩選

天麻制片過程中，解離尤為重要，是制片的關鍵，解離效果不好，細胞軟化不夠，天麻組織擠壓不開，染色體分散不開，經對比發現，天麻組織中細胞壁的軟化和解離通過1M HCL60oC恒溫5min，效果可以達到最佳。

3.3 染色劑篩選

Giemsa和改良石炭酸品紅染色效果對比發現，天麻標本制作過程中，Giemsa著色淺，不能較好的將染色體著色，改良石炭酸品紅染色30min后，通過圖片處理軟件可使圖片達到核型分析要求，50min后最佳，看到較為清晰的染色體，隨著時間延長，背景著色隨之加深。

3.4 制片方法的確定

通過對阻斷劑、解離手段和染色劑的篩選，結合去壁、低滲方法，最終確定天麻染色體的制片流程為：取材（柱頭）——預處理——固定——前低滲——解離——后低滲——固定——染色50min——壓片——鏡檢。

1）取材。柱頭取材：自然條件下（上午9：00-11：00），開花前5天內，取柱頭；原球莖取材：上午9：00-11：00，取2-3mm左右的原球莖；生長點分生組織取材：上午9：00-11：00取新生長子（白）麻前端組織。

2）預處理。將材料置于0.003%/L 8-羥基喹啉中，室溫處理50min左右，取出用蒸餾水漂洗2-3次。

3）固定。然后用新配的卡諾固定液進行固定，時間為1h。

4）前低滲。柱頭用蒸餾水洗3次，加入0.75mol/L KCL作前低滲30min。

5）解離。前低滲后的柱頭用蒸餾水漂洗2-3次，加入1M鹽酸，60oC水浴，5min解離。

6）后低滲。將解離后的柱頭用蒸餾水漂洗2-3次，最后1次浸蒸餾水30min作后低滲。

7）固定。吸去蒸餾水，加入新配卡諾固定液（冰醋酸∶甲醇＝1∶3）固定1h。

8）染色。將固定后的材料（組培材料取莖尖0.2cm）置于干凈載玻片上，加改良后的卡寶品紅染液1-2滴，染色50min。

9）制片。用45%的冰醋酸洗1-2次，取干凈的蓋玻片蓋在材料上，先用鉛筆頭或者鑷子輕輕敲打，再用拇指壓片。

10）鏡檢 制備好后的標本在顯微鏡下觀察，對分裂相好的細胞進行觀察、拍照。

4 討論與分析

通過本文中的方法，可以較好的制備出天麻染色體有絲分裂期標本。從圖4中A-E可以看出，可以清晰的觀察到天麻染色體有絲分裂過程結構變化，從間期的細胞核的體積增大，染色質和細染色體螺旋纏繞并逐漸縮短變粗形成染色體，核膜破裂后染色體分散于細胞質中。由于極微管和著絲微管之間的相互作用，染色體向赤道面運動。最后在紡錘體的作用下向兩級遷移，最后細胞膜已經形成，形成兩個獨立細胞過程。

8-羥基喹啉和秋水仙素均抑制有絲分裂的這一特性，使其成為研究細胞染色體的常用工具藥。是染色體分析實驗中的關鍵步驟，在風信子、馬鈴薯和人類外周血淋巴細胞方面的染色體研究中都有應用。在篩選對比實驗中，8-羥基喹啉只需要50min就可以達到效果，而秋水仙素則需要1.5h才能達到最佳效果，相對來說，秋水仙素在誘變育種中應較多，而8-羥基喹啉在細胞染色體研究中應用較多[10-13]。

低滲的目的在于使細胞吸收水分而膨脹，染色體分散到細胞質中，在制片時便于染色體分散開，這一方法可以應用到天麻染色體有絲分裂的標本制備中去。去壁、低滲法在37個科105種植物中進行過應用[9]，均取得較好的效果。天麻也適合這一方法。

天麻染色體有絲分裂標本制備過程中，使用混合酶液（果膠酶+纖維素酶）去除細胞壁在天麻柱頭這一材料中效果并不理想，而用1M鹽酸60oC水浴5min解離效果更佳。細胞組織分散不開，不能獲得較為理想的圖片。即使延長了后低滲的時間，效果液也并不理想[9]。這可能與水浴設備或者溫控設備有關系。

圖4 天麻染色體有絲分裂不同時期表本圖

同時，筆者在前期工作中發現天麻開花后隨著時間的推移，其柱頭表面粘性逐漸減弱，組織結構逐漸變硬，導致制備染色體有絲分裂中期標本過程中解離難度增加。前期的工作中發現，開花3天后的柱頭很難獲得分散較好的細胞標本。這可能是柱頭暴露在空氣中后，水分揮發導致其組織結構收縮變硬，粘性減弱，柱頭組織恢復難度大的原因所導致。