高倍鏡觀察線粒體的實驗設(shè)計

牛元林

【內(nèi)容摘要】線粒體是為生命活動提供能量的細(xì)胞器，普遍存在于動植物細(xì)胞中，在顯微鏡下能否觀察到線粒體，是我們認(rèn)識和研究這一細(xì)胞器的基礎(chǔ)，也是激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的重要手段。然而高中生物課本對口腔上皮細(xì)胞線粒體觀察實驗設(shè)計過于簡單，實驗現(xiàn)象不夠明顯，最大的問題是染液濃度過高，使染色后的口腔細(xì)胞所有結(jié)構(gòu)均染成藍(lán)紫色，根本看不到線粒體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致實驗以失敗告終，大大挫傷學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，為此對這一實驗的改進(jìn)是十分必要的。

【關(guān)鍵詞】亮綠色 桔黃色 淺綠色淺紅色

目的

1.學(xué)習(xí)并掌握不同染液對線粒體染色和觀察的基本方法。

2.了解口腔上皮細(xì)胞中線粒體的形態(tài)，分布，數(shù)量。

3.培養(yǎng)學(xué)生運用發(fā)散性思維方式解決問題的能力。

用品

1.器材：顯微鏡，蓋玻片，載玻片，滴管，鑷子，牙簽。

2.試劑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的健那綠水溶液稱A液（可用1滴英雄牌藍(lán)墨水+2ml水的藍(lán)墨水染液代替）。1滴英雄牌紅墨水+10ml水混合均勻稱B液，蘇丹3（0.1克）+100ml95%酒精混合均勻稱C液。

原理

口腔上皮細(xì)胞中的線粒體數(shù)量幾百到上千個，形態(tài)多數(shù)呈圓球狀，少數(shù)為短棒狀，其中線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶能使健那綠，藍(lán)墨水，紅墨水，蘇丹3染液保持氧化狀態(tài)，分別使線粒體呈現(xiàn)亮綠色，淺綠色，淺紅色，桔黃色。而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無色。

方法

1.A液染色時裝片的制作與觀察

滴一滴清水于載玻片上，用牙簽在漱凈的口腔內(nèi)側(cè)輕輕刮幾下，將附有口腔細(xì)胞的牙簽在載玻片的一滴清水中擺動幾下，再滴一滴A液，染色2～3分鐘，蓋上蓋玻片，置于16×10倍鏡下觀察，找到細(xì)胞質(zhì)無色透明，其中散落著亮綠色小顆粒（線粒體）的細(xì)胞，或細(xì)胞質(zhì)呈淺藍(lán)色，其中線粒體呈藍(lán)綠色的細(xì)胞，然后，換用16×40倍顯微鏡觀察。

注意事項：觀察到清晰的線粒體后，要輕微調(diào)節(jié)微調(diào)，邊調(diào)節(jié)邊觀察。注意觀察不同焦距下細(xì)胞中不同部位的線粒體。

2.動態(tài)和靜態(tài)口腔上皮細(xì)胞的觀察

用牙簽輕輕觸壓一下步驟1的細(xì)胞裝片的蓋玻片，同時在16×10倍鏡下觀察染液中運動和靜止?fàn)顟B(tài)下的口腔細(xì)胞，尤其注意觀察翻轉(zhuǎn)運動的細(xì)胞和線粒體清晰可見的細(xì)胞。觀察運動的細(xì)胞可以看到口腔上皮細(xì)胞的全方位構(gòu)造，更要注意觀察細(xì)胞前后徑即薄厚程度不同的細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)，少數(shù)細(xì)胞前后徑較大，細(xì)胞比較飽滿，多數(shù)細(xì)胞前后徑中等，部分細(xì)胞前后徑較小，同一細(xì)胞不同部位的薄厚也是不同的，有的細(xì)胞不同部位還折疊在一起等形態(tài)特點。觀察線粒體清晰可見的運動著的細(xì)胞時，注意觀察分布在細(xì)胞不同部位的線粒體。靜態(tài)細(xì)胞的觀察，注意觀察不同姿態(tài)的細(xì)胞，重點仔細(xì)觀察直立的，傾斜的，平鋪的，重疊的，折疊的細(xì)胞特點。所有這些觀察能更好幫助我們認(rèn)識線粒體在細(xì)胞中的分布和形態(tài)特點。

3.不同染液染色時臨時裝片的制作與觀察

分別用B液、C液、藍(lán)墨水對口腔上皮細(xì)胞染色，其中染色，觀察的方法與步驟1相同，只是蘇丹3染液將線粒體染成桔黃色，紅墨水染液將線粒體染成淺紅色，藍(lán)墨水與健那綠使線粒體呈現(xiàn)相似的顏色。觀察過程中要重點尋找如下圖片，并仔細(xì)觀察細(xì)胞中線粒體的存在狀態(tài)。

說明：上述圖片中的線粒體在16×40倍鏡下比16×10倍的鏡下更清晰，能更清楚看到蘇丹3，健那綠，藍(lán)墨水，紅墨水染色后線粒體分別呈桔黃色，亮綠色，淺紅色，淺綠色。

質(zhì)疑

1、這一實驗?zāi)艿贸鲈鯓拥膶嶒灲Y(jié)論？

2、為什么同一細(xì)胞不同部位的線粒體只有在不同焦距下才能看得到？

3、為什么絕大多數(shù)細(xì)胞中的線粒體呈大小不一，分布不均勻的點狀結(jié)構(gòu)，只有少數(shù)細(xì)胞中線粒體是清晰可見的圓球狀或短棒狀？

拓展

實驗研究發(fā)現(xiàn)，生物細(xì)胞中的線粒體主要集中在生命力旺盛，分泌能力強大的動植物器官，組織細(xì)胞里，只是不同生物細(xì)胞中線粒體數(shù)量不同，形態(tài)各異。如：洋蔥，大蒜，百合，馬鈴薯等，它們的根尖部位的分生組織細(xì)胞中，洋蔥，百合的鱗片表皮細(xì)胞中，瓜類植物如黃瓜，西瓜，南瓜，西葫蘆等植物的幼嫩瓜藤的纖毛細(xì)胞中，絲瓜，冬瓜等的果實表面纖毛細(xì)胞中，都含有線粒體。

經(jīng)過對校園植物館的太陽花，萬壽菊，孔雀草，黃花菜，油菜花，沙漠地帶的馬蘭花等植物的新鮮花瓣表皮纖毛的鏡下觀察，動物中魚類的新鮮魚子，鴿子，牛羊的肝臟，腎臟，心肌組織細(xì)胞經(jīng)過嚴(yán)格線粒體篩選，分離，提純觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均廣泛存在線粒體。對單細(xì)胞微生物酵母菌特殊染色后觀察，也存在線粒體，但數(shù)量極少。因此觀察亞顯微結(jié)構(gòu)線粒體的材料來源豐富。

那么通過什么方法，采取怎樣的措施完成細(xì)胞中線粒體分離提取，是認(rèn)識、觀察、研究線粒體的基礎(chǔ)。為此我們選擇了幾種比較理想的材料開展如下活動。

活動一：1、材料用品：剪刀，鑷子，培養(yǎng)皿，載玻片蓋玻片，紗布，濾紙條，顯微鏡，洋蔥鱗片，洋蔥根尖，百合鱗片，百合根尖，20%鹽酸，0.005%健那綠染液。2、實驗方法：用剪刀剪去約1厘米的洋蔥和百合根尖，分別放在兩個培養(yǎng)皿中，加入約1毫升20%鹽酸溶液浸泡5分鐘，然后用鑷子取出根尖放入蒸餾水浸泡2分鐘左右，將處理好的洋蔥和百合根尖分別放置在擦拭干凈的載玻片中央，分別滴一滴健那綠染液染色2分鐘，放上蓋玻片，用濾紙條吸取多余染液，再用橡皮擦輕輕敲打蓋玻片盡量使根尖組織細(xì)胞分散開來，放在低倍顯微鏡觀察伸長區(qū)細(xì)胞，之后換用高倍鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)分散著藍(lán)綠色的小顆粒-線粒體，仔細(xì)對比洋蔥和百合根尖伸長區(qū)細(xì)胞中線粒體的分布，形態(tài)，數(shù)量。3、實驗結(jié)論：洋蔥百合根尖線粒體主要分布在細(xì)胞質(zhì)中靠近細(xì)胞膜的區(qū)域，細(xì)胞核周圍線粒體稀少，大多呈藍(lán)綠色顆粒狀。4、注意事項：根尖要選擇生長最快的；染液濃度不能過高；染色時間不宜過長或過短；制片中的敲擊力量要適中，避免細(xì)胞過分分散或多層重疊，影響觀察效果。

活動二：選取盛開的太陽花，孔雀草，菊花花瓣，幼嫩瓜藤為實驗材料按活動一設(shè)計實驗，開展活動，活動中要選擇淺色花瓣，用鑷子取下植物表面纖毛，再置與載波片中央的水滴中無需染色，蓋上蓋玻片在高倍鏡下即能看到細(xì)胞中線粒體。

活動三：動物肝臟的一個細(xì)胞中大約有1000～2000個線粒體，因此實驗室常用新鮮動物肝臟為材料分離，提純線粒體，也是觀察研究線粒體的首選素材。但實驗過程更為復(fù)雜，要求更為嚴(yán)格，動員學(xué)生上網(wǎng)查詢，學(xué)習(xí)動物肝臟中提取線粒體的實驗原理，方法步驟，操作要領(lǐng)，注意事項，掌握差速分離線粒體的技術(shù)，學(xué)會勻漿介質(zhì)的配制方法。為更深層次探究微觀領(lǐng)域打下堅實基礎(chǔ)。

（作者單位：甘肅省玉門市第一中學(xué)）