響應曲面法優化木聚糖酶解法制備玉米秸稈低聚糖工藝研究

嵇 威，李饒樺，錢時權

（淮陰師范學院，生命科學學院，江蘇省區域現代農業與環境保護協同創新中心，江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室，江蘇省食品質量安全與營養功能評價重點建設實驗室，江蘇淮安 223300）

玉米秸稈是供作飼料為主的糧、經、飼兼用作物，同時也是農業生產的重要廢棄物。我國有著極其豐富的玉米秸稈資源，每年產量達2.65 億t 左右[1-2]，大部分被直接焚燒或還田，得不到充分的利用。玉米秸稈含有纖維素、半纖維素和木質素等大分子碳水化合物，利用木聚糖酶酶解這些大分子化合物可以進一步制備功能性低聚糖[3-5]。研究表明，功能性低聚糖可替代蔗糖廣泛應用在飲料、乳制品、調味品和糖果等食品中[6-7]。目前，國內已有大量關于玉米秸稈資源在飼料、肥料、燃料、食用菌基料、工業原料等方面的開發利用報道[8-10]。盡管如此，利用木聚糖酶酶解玉米秸稈制備低聚糖的研究文獻很少。

目前，農作物秸稈功能性糖的提取方法主要有熱解法和酶解法。熱解法得到的低聚木糖產率雖高，但高溫熱解過程中易產生一些對人體有害的副產物。酶解法利用木聚糖酶的專一性和高效性，能有效降解秸稈中的木聚糖形成低聚糖。以玉米秸稈為原料，研究木聚糖酶解對玉米秸稈低聚糖提取的影響，并在此基礎上利用響應曲面法對玉米秸稈低聚糖酶解提取工藝進行了優化，旨在為玉米秸稈資源的高效開發利用提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

玉米秸稈，采集自淮安郊區農場；木聚糖酶（100 000 U/g）、3,5 - 二硝基水楊酸試劑、氫氧化鈉、酒石酸鉀納、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、濃鹽酸、水楊酸鈉、水楊酸、無水乙醇、95%乙醇、氯化鈉、鐵氰化鉀三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵，均為分析純，以上試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16C 型高速離心機，上海安亭科學儀器廠產品；722G 型紫外可見分光光度計，上海光學儀器廠產品；FA214 型電子分析天平，上海精密儀器有限公司產品；HH 型恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠產品；ZWY-110H 型恒溫振蕩器，上海智誠分析儀器制造公司產品；KH-45A 型恒溫干燥箱，廣州康恒儀器有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 玉米秸稈低聚糖的提取

2.1.1 玉米秸稈木聚糖的提取

選取形態良好的玉米秸稈，曬干后粉碎，在60 ℃下烘制至恒質量，過60 目篩制成粉末。準確稱取5.00 g 玉米秸稈粉末于錐形瓶中，加入100 mL 蒸餾水，加入質量分數為8%的NaOH 溶液，置于90 ℃水浴鍋中蒸煮2 h，蒸煮液以轉速6 000 r/min 離心10 min，收集上清液。向上清液中加入0.5 mol/L的HCl 至pH 值為6.0，再加入質量分數為5%的H2O2放置一段時間脫色處理；向脫色過后的溶液中加入3 倍體積的95%乙醇，4 ℃下醇沉12 h，以轉速6 000 r/min離心10 min，收集沉淀，經真空干燥后研磨，得到玉米秸稈木聚糖粉末。

2.1.2 玉米秸稈低聚糖的制備

稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，加入一定量的木聚糖酶，調節pH 值，放入恒溫振蕩器中加快酶解。酶解結束后，于沸水中10 min 滅酶，冷卻后以轉速6 000 r/min 離心10 min，收集上清液，得到玉米秸稈低聚糖溶液。按2.1.1 中的方法得到玉米秸稈低聚糖粉末備用。

2.2 玉米秸稈低聚糖提取率及平均聚合度的測定

該方法參考何亮亮[11]的方法。取1 mL 玉米秸稈低聚糖溶液于試管中，加入1.5 mL DNS 試劑，搖均后于沸水浴中保溫5 min，拿出冷卻至室溫后定容至25 mL，取一定體積溶液于波長540 nm 處測定吸光度，以蒸餾水為對照液，平行測定3 次，取平均值。另取1 mL 玉米秸稈低聚糖溶液，加入1.5 mL DNS試劑和2 mol/L H2SO4溶液1 mL，于沸水浴中保溫30 min，拿出冷卻至室溫后，以質量分數為20%的NaOH 溶液中和至中性，定容至25 mL，取一定體積于波長540 nm 處測定吸光度，以蒸餾水對照，平行測定3 次，取平均值。

式中：A1——加入硫酸銅前波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度；

A2——加入硫酸銅后波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度；

M——玉米秸稈粉末的質量，g。

式中：A1——加入硫酸銅前波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度；

A2——加入硫酸銅后波長540 nm 處低聚糖溶液的吸光度。

2.3 酶解法提取玉米秸稈低聚糖單因素試驗

2.3.1 酶質量分數對玉米秸稈低聚糖提取率的影響

準確稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，在保持其他條件不變時，分別加入質量分數為1.0%，1.3%，1.5%，1.7%，1.9%，2.0%的酶，按照2.1.2和2.2 方法提取低聚糖，計算低聚糖提取率，考查酶質量分數對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，比較不同提取率下低聚糖聚合度的差異。

2.3.2 酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率的影響

準確稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，加入一定量的酶，保持其他條件不變，按酶解時間為2，4，6，8，10，12 h，按照2.1.2 和2.2 方法提取低聚糖，計算低聚糖提取率，考查酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，比較不同提取率下低聚糖聚合度的差異。

2.3.3 pH 值對玉米秸稈低聚糖提取率的影響

準確稱取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，保持其他條件不變，按照酶解時pH 值為1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，按照2.1.2 和2.2 方法提取低聚糖，計算低聚糖提取率，考查酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，比較不同提取率下低聚糖聚合度的差異。

2.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取酶質量分數（A）、酶解時間（B） 和pH 值（C） 3 個因素，以玉米秸稈低聚糖提取率（Y） 為響應值，采用Box-behnken 試驗設計方法優化玉米秸稈低聚糖提取工藝參數。

試驗因素與水平設計見表1。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

表1 試驗因素與水平設計

3.1.1 酶質量分數對玉米秸稈低聚糖提取率和聚合度的影響

酶質量分數對低聚糖提取率和聚合度的影響見圖1。

由圖1 可知，隨著酶質量分數的增加，低聚糖提取率先升高后下降，最后基本不變；原因可能是反應剛開始時，木聚糖酶迅速酶解木聚糖得到較多的低聚糖，所以隨著酶質量分數的增加，低聚糖含量逐漸升高，當酶質量分數增加到一定量后，會抑制反應的進行，從而導致低聚糖得率下降，最后達到新的平衡，故最后低聚糖提取率不變。從圖1 同時可以看出，低聚糖的平均聚合度隨著酶質量分數的增加，呈現出跟提取率相同的變化趨勢，可能與酶解反應的程度有關。在酶質量分數為1.3%時，低聚糖提取率和平均聚合度達到最大。因此，酶質量分數選擇1.3%為適宜。

3.1.2 酶解時間對玉米秸稈低聚糖提取率和聚合度的影響

酶解時間對低聚糖提取率和聚合度的影響見圖2。

由圖2 可知，玉米秸稈低聚糖提取率和平均聚合度隨酶濃度增加呈現先升高后下降的趨勢，原因可能是因為反應時間過長，酶的活力下降和部分低聚糖發生水解造成提取率下降和聚合度下降。在酶解時間為6 h 時低聚糖提取率和平均聚合度達到最大。因此，酶解時間為6 h 較為適宜。

3.1.3 pH 值對玉米秸稈低聚糖提取率和聚合度的影響

pH 值對低聚糖提取率和聚合度的影響見圖3。

由圖3 可知，隨著pH 值的升高，低聚糖提取率和平均聚合度同步變化，均線上升后下降，原因是pH 值過高或過低都會使木聚糖酶失活，導致低聚糖提取率下降。低聚糖提取率在pH 值為5.0 時達到最大，此時平均聚合度也最佳，本著提高低聚糖產率的期望，pH 值為5.0 最合適。

3.2 響應面法優化玉米秸稈低聚糖提取工藝

綜合分析單因素試驗結果，選取酶質量分數（A）、酶解時間（B） 和pH 值（C） 為自變量，以低聚糖提取率（Y） 為響應值，進行響應面優化。

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果

由表2 可知，建立玉米秸稈低聚糖提取率對酶濃度、酶解時間和pH 值二次多元回歸方程為：

方差分析見表3。

表3 方差分析

對表2 和表3 比較分析，得到的模型（p＜0.000 1）顯著，而且該模型的擬合度較好，因為失擬項不顯著（p=0.748＞0.05）；R2=0.997 7，說明低聚糖提取率99.77%的變異都能通過此模型解釋。在分析的結果中，其中一次項A 和C 極其顯著（p＜0.000 1），表明酶質量分數和pH 值對低聚糖提取率影響極顯著。同時，交互項（AB、AC、BC） 和二次項（A2、B2、C2） 對提取率的影響也都極為顯著（p＜0.01）。由F值大小可知，影響玉米秸稈低聚糖提取率主要因素主次順序為A＞C＞B，即酶質量分數＞pH 值＞酶解時間。

3.3 響應面分析

根據回歸方程，得出酶質量分數、酶解時間和pH 值對低聚糖提取率影響的響應面圖和等高線圖。

酶質量分數和酶解時間交互作用對低聚糖提取率的影響見圖4。

由圖4 可知，當固定條件為pH 值時，另外2 個因素酶質量分數和酶解時間逐漸升高時，玉米秸稈低聚糖的提取率，表現為先升高后降低的趨勢。

酶質量分數和pH 值交互作用對低聚糖提取率的影響見圖5。

由圖5 可知，當固定條件為酶解時間時，酶質量分數和pH 值對低聚糖提取率交互作用對提取率的影響極為顯著，表現為隨著酶質量分數和pH 值的升高先升高后下降。

酶解時間和pH 值交互作用對低聚糖提取率的影響見圖6。

由圖6 可知，當固定條件為酶質量分數時，低聚糖提取率隨酶解時間和pH 值的變化而變化，表現為隨酶解時間和pH 值的增大先上升后下降，由響應面圖和等高線圖可知，當低聚糖提取率達到一定值后不再增加[12]。

通過回歸模型和響應曲面法對參數的最優化分析，得出酶解法制取玉米秸稈低聚糖的最佳條件為酶質量分數1.3%，酶解時間6.12 h，pH 值5.45，在此工藝條件下，得到低聚糖提取率的最大預測值為59.3%。考慮到實際操作情況，對最佳條件進行了適當調整：酶質量分數1.3%，酶解時間6.12 h，pH 值5.40，在此工藝條件下進行3 次重復試驗，得到玉米秸稈低聚糖的實際提取率為59.24%，平均誤差為1.13% （n=3），試驗值與理論值基本吻合。以上結果表明，所獲得的模型能有效用于玉米秸稈低聚糖提取。

4 結論

采用了酶解法提取玉米秸稈低聚糖，研究了酶質量分數、酶解時間、pH 值對玉米秸稈低聚糖提取率的影響，并考查了低聚糖的平均聚合度；采用響應曲面法優化了酶解法提取玉米秸稈低聚糖的工藝條件。結果表明，酶質量分數、酶解時間和pH 值對低聚糖提取有顯著影響。得到酶解法制備玉米秸稈低聚糖的最佳工藝條件為酶質量分數1.3%，酶解時間6 h，pH 值5.40，在此條件下玉米秸稈低聚糖的提取率為59.24%。