食品中赤蘚紅HPLC 檢測方法優化

陸雅麗，萬 程，許 斌，陳舒憶，劉 鑫，李美位

（1.貴陽市食品藥品檢驗檢測中心，貴州貴陽 550081；2.江西農業大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045）

0 引言

色素是一種食品添加劑，食用色素分為天然色素和合成色素2 種。合成色素價格低廉、穩定性好，在食品工業中被廣泛應用，但是合成色素具有一定的毒性，對人體健康存在一定的危害作用[1-3]。楊娟艷等人[4]報道過餐飲食品中存在濫用合成色素的現象。因此，合成色素的檢測對我國的食品質量安全的監管具有十分重要的意義。

國標GB 5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》[5]中，赤蘚紅色素的檢測不能和胭脂紅等其他6 種色素采用同樣的前處理方法，赤蘚紅色素單獨的前處理過程無疑加重了檢測工作。GB 5009.35—2016 檢測胭脂紅等6 種色素時采用聚酰胺吸附法，赤蘚紅色素的檢測需要采用液-液分配法。在實際檢測工作中發現，一些紅糖等顏色深、糖分含量高的食品采用國標GB 5009.35—2016 檢測赤蘚紅色素時，國標中的方法對赤蘚紅色素的前處理效果不理想，不僅赤蘚紅色素提取過程繁瑣，更不能有效去除雜質（若最終上機的溶液不能有效去除雜質，對液相色譜柱的損耗較大），如果能把赤蘚紅和其他色素同時進行前處理，既簡化了檢測工作，還可以保護高值耗材-高效液相色譜柱，延長液相色譜柱的使用壽命。

選擇食品色素中常見的胭脂紅和日落黃，和赤蘚紅一同研究色素前處理過程，通過檢測色素的回收率來驗證色素前處理過程中是否有效。并通過試驗研究前處理過程中各種試劑試藥對色素回收率的影響，也為后期研究色素的質量標準研究提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤蘚紅、胭脂紅、日落黃，中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜級）、甲酸、乙酸銨、無水乙醇、氨水、聚酰胺粉（100～200 目）。

1.2 儀器與設備

Agilent Infinity 1260 型高效液相色譜儀，上海和泰產品；Master-s 型純水機；BSA224S 型天平；AISITE DFD-700 型水浴鍋等。

1.3 試驗方法

參照國標GB 5009.35—2016《食品安全國家標準食品中合成著色劑的測定》[5]，樣品溶液（由色素標準物質制成1 μg/mL 的溶液） 加檸檬酸溶液調pH 值至6，加熱至60 ℃，將1 g 聚酰胺粉加少許水調成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G3 垂融漏斗抽濾，用60 ℃，pH 值為4 的水洗滌3～5 次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗滌3～5 次，再用水洗至中性，用乙醇- 氨水溶液- 水混合溶液解析3～5 次，直至色素完全解析，收集解析液，加乙酸中和，蒸發至近干，加水溶解，定容至5 mL。經0.45 μm 微孔濾膜過濾，置于高效液相色譜儀中進行分析。

該試驗過程中60 ℃，pH 值為4 的水、甲醇-甲酸混合溶液是洗脫溶液，乙醇-氨水溶液-水混合溶液是解析溶液。

乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g 乙酸銨，加水至1 000 mL 溶解，經0.45 μm 微孔濾膜過濾。

氨水溶液：量取氨水2 mL，加水至100 mL，混勻。

甲醇- 甲酸混合溶液：量取甲醇60 mL，甲酸40 mL，混勻。

檸檬酸溶液：稱取20 g 檸檬酸，加水至100 mL，溶解混勻。

pH 值6 的水：水加檸檬酸溶液調pH 值到6。

pH 值4 的水：水加檸檬酸溶液調pH 值到4。

1.4 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進樣量10 μL，柱溫35 ℃，紫外檢測器波長254 nm，流動相梯度洗脫。

流動相梯度洗脫見表1。

表1 流動相梯度洗脫

2 結果與分析

2.1 考查解析溶液對赤蘚紅色素回收率的影響

分別考查以下解析溶液：乙醇∶氨水溶液∶水=3∶1∶X，2∶1∶X，1∶1∶X，0∶1∶X，1∶0∶X。其中，水的比例X 均為10%，乙醇和氨水溶液共占90%，根據不同比例調整。按照1.3 的試驗方法，因為考查解析溶液對回收率的影響，因此以G3 垂融漏斗抽濾后直接用解析溶液解析5 次，收集解析液，加乙酸中和，蒸發至近干，加水溶解，定容至5 mL。

該試驗最終定容溶液的顏色差別較大，僅從最終定容溶液的顏色可判別出不同解析溶液對赤蘚紅色素的回收率的影響。試驗結果表明，乙醇∶氨水溶液∶水= 2∶1∶X，即解析溶液為乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10 時解析溶液對赤蘚紅色素的解析效果最好，赤蘚紅色素回收率最高。參照GB 5009.35—2016 中解析溶液是乙醇∶氨水溶液∶水= 70∶20∶10，因此選擇乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10 和乙醇∶氨水溶液∶水= 70∶20∶10 這2 種解析溶液進行后續的試驗研究。

2.2 考查洗脫溶液和解析溶液對色素回收率的影響

國標GB 5009.35—2016 中60 ℃，pH 值4 的水等洗脫溶液的作用是洗去樣品溶液中的糖等雜質，便于高效液相色譜分析。試驗研究不同洗脫溶液和解析溶液對色素回收率的影響。

洗脫溶液考查60 ℃，pH 值4 的水、甲醇、甲醇∶甲酸= 6∶4、甲酸4 種溶液，解析溶液考查乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10 和乙醇∶氨水溶液∶水= 70∶20∶10 兩種溶液，并選用胭脂紅、日落黃、赤蘚紅3 種色素制成混合色素樣品溶液來考查不同洗脫溶液和解析溶液對各種色素回收率的影響，為精確測定色素的回收率，采用高效液相色譜儀測定最終定容溶液中的色素含量，檢測不同前處理方法對色素回收率的影響。

色素回收率1 見表2。

試驗結果表明，洗脫溶液為甲酸時，3 種色素的回收率均在62%以下，洗脫溶液為甲醇∶甲酸= 6∶4 混合溶液時，胭脂紅和日落黃的回收率均在84%以上，但是赤蘚紅的回收率均在58%以下，通過對比其他2 組試驗數據，洗脫溶液含甲酸時，赤蘚紅色素的回收率會明顯降低。溫度60 ℃，pH 值4 的水、甲醇2 種洗脫溶液得出的色素回收率均在81%以上。當洗脫溶液為甲醇，解析溶液為乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10 時，3 種色素的回收率較高，洗脫溶液為60 ℃，pH 值4 的水、甲醇∶甲酸= 6∶4、甲酸，2 種解析溶液乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10 和乙醇∶氨水溶液∶水= 70∶20∶10 對色素回收率的影響差別不明顯。

2.3 進一步考查洗脫溶液和解析溶液對色素回收率的影響

綜合試驗2.2，表明60 ℃，pH 值4 的水和甲醇2 種洗脫溶液提取的色素回收率均在81%以上，因此考查60 ℃，pH 值4 的水和甲醇組合洗脫溶液對色素回收率的影響，為加強試驗結果的對比性，用60 ℃，pH 值4 的水和甲醇2 種單一的洗脫溶液做對比試驗，同時繼續考查2 種不同解析溶液乙醇∶氨水溶液∶水比例為70∶20∶10 和60∶30∶10 對色素回收率的影響。

表2 色素回收率1

色素回收率2 見表3。

試驗結果表明，洗脫溶液為甲醇，解析溶液為乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10 時，3 種色素的回收率均最高。組合洗脫溶液的色素回收率沒有單一洗脫溶液的色素回收率高，每增加一種洗脫溶液，色素的回收率會有所下降。上述試驗中組合洗脫溶液和60 ℃，pH 值4 的水對赤蘚紅回收率影響較大。因此，含赤蘚紅的食品檢測色素時可以采用甲醇作為洗脫溶液并用乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10作為解析溶液。

表3 色素回收率2

3 結論

參照國標GB 5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》，含赤蘚紅色素的食品檢測色素時可以采用的前處理方法如下：用甲醇作為洗脫溶液，再用乙醇∶氨水溶液∶水= 60∶30∶10 作為解析溶液，該條件下胭脂紅回收率為91.9%，日落黃回收率為94.2%，赤蘚紅回收率為92.6%。國標GB 5009.35—2016 檢測赤蘚紅色素時，不能和胭脂紅等色素采用同樣的前處理方法是因為國標方法前處理過程中的洗脫溶液甲醇-甲酸混合溶液對赤蘚紅色素的損耗較大，其次是60 ℃，pH 值4 的水。因此，含有赤蘚紅色素的食品檢測色素時前處理過程中應盡量避免這2 種溶液。色素檢測前處理過程中每增加一種洗脫溶液，色素的回收率都會有所下降。因此，在保證色素檢測結果準確的條件下應當盡可能減少前處理過程中洗脫溶液的種類和洗脫次數。