鹽脅迫對槲樹(Quercus dentata)幼苗離子平衡及其生理生化特性的影響

郝 漢,曹 磊,陳偉楠,胡增輝,冷平生,*

1 北京農學院園林學院,北京農學院林木分子設計育種高精尖創新中心, 北京 102206 2 北京三元綠化工程有限公司, 北京 100026 3 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所, 北京 100091

槲樹(QuercusdentataThunb.)是北京地區的重要鄉土樹種之一,具有涵養水源,保持水土的作用。槲樹樹冠廣展,秋葉呈橙紅色,葉大且形狀奇特,園林造景價值高。北京地區槲樹資源豐富,主要分布在北京西部和北部山區弱酸性土壤環境中,而在北京城市園林綠化中卻極為少見,這可能與平原地區土壤偏鹽堿性相關。北京園林綠化局將槲樹列為城市森林建設的骨干鄉土樹種,因此,了解槲樹的耐鹽性是十分必要的。

櫟類樹種的生態適應性較強,在干旱及土壤瘠薄立地條件下均能良好生長。近些年已有學者對櫟樹的耐鹽性展開研究,如：李向應等比較了鹽脅迫對北京槲櫟(Q.alienaBl. var.pekingensisSchott.)和銳齒槲櫟(Q.alienaBl. var.acuteserrataMaxim. ex Wenz.)離子分布及生理特性影響,北京槲櫟耐鹽性優于銳齒槲櫟,更適宜北京地區的園林綠化[1]。從根系發育及離子運輸方面分析了麻櫟(Q.acutissimaCarruth.)和弗吉尼亞櫟(Q.virginianaMill.)2樹種的耐鹽性,弗吉尼亞櫟具有較強耐鹽性,麻櫟則為鹽敏感型植物[2]。李志萍等研究了栓皮櫟(Q.variabilisBl.)在NaCl脅迫下的生理響應,指出栓皮櫟能夠耐受0.6%濃度的鹽脅迫[3]。不同櫟樹的耐鹽性存在差異,但對其耐鹽機制仍了解不多。來自其他植物材料的大量研究表明,鹽脅迫下植物體內離子和生理生化指標的變化與其耐鹽能力高度相關。黃連木(PistaciachinensisBunge.)在高濃度NaCl脅迫下產生離子毒害,細胞膜透性增大,引起細胞代謝失調[4]。衛矛(Euonymusalatus(Thunb.) Sieb.)、沙棗(ElaeagnusangustifoliaLinn.)和美國白蠟(FraxinusamericanaLinn.)在鹽脅迫下根莖葉中Na+含量升高,K+含量變化卻呈現不同規律[5]。NaCl處理下冰葉日中花(MesembryanthemumcrystallinumL.)迅速積累滲透調節物質并提高抗氧化酶活性,以適應鹽脅迫[6]。高濃度鹽脅迫使紅麻(ApocynumvenetumL.)、五葉地錦(Parthenocissusquinquefolia(L.) Planch.)葉片中可溶性糖、脯氨酸顯著積累[7-8]。鹽脅迫下對青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.)生長和根系離子變化研究表明,其耐鹽閾值在1 g/L-1左右[9]。曹磊等研究了鹽脅迫條件下槲樹的光合響應及葉綠素熒光變化,表明槲樹幼苗對鹽堿脅迫具有較強的抗性[10]。而槲樹在鹽脅迫下的離子平衡情況以及生理生化響應仍不清楚。本研究擬對槲樹幼苗進行鹽脅迫試驗,分析其生理生化特性與離子濃度的變化,為進一步揭示槲樹的耐鹽性提供數據支撐,以期為槲樹應用于北京城市地區甚至華北平原園林綠化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將采集于北京平谷玻璃臺林場的槲樹種子,在溫室砂藏催芽后,于2016年11月27日播種于規格為盆高20 cm,直徑22 cm的塑料花盆中,基質配比為草炭:沙子:雞糞=5:3:1,實驗用盆下置托盤,定期除草、澆水、施肥,保證槲樹苗長勢良好。

1.2 鹽脅迫處理

2017年9月,選擇長勢一致的槲樹幼苗進行鹽脅迫實驗。分別用100、200、300 mmol/L的NaCl進行澆灌處理,每10天向盆中澆灌用去離子水配制的鹽溶液500 mL(對照加等量去離子水),保證溶液完全加入且不溢出托盤,每天對實驗苗進行稱重補水,補水時先沖洗托盤上的鹽粒,將洗液倒入盆中,避免鹽分流失,以保持盆內鹽濃度一致。實驗持續30 d,300 mmol/L濃度NaCl脅迫第20天和200 mmol/L鹽脅迫第30天,槲樹葉片分別出現皺縮。300 mmol/L鹽脅迫第30天,葉片皺縮進一步加重,葉緣焦黃,并出現大量黃褐斑,部分植株致死。鹽脅迫第10、20、30天分別采集槲樹幼苗大小適中的功能葉進行生理生化指標的測定。將整株槲樹幼苗根、莖、葉分別烘干,進行離子含量測定。

1.3 指標測定及方法

根據葉樣鮮重和干重測定葉片含水量[11],用電導儀法測定葉片電導率[12],丙二醛含量用硫代巴比妥酸法測定[11],可溶性糖含量用蒽酮法測定[11],游離脯氨酸含量用茚三酮顯色法測定[11],過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性的測定分別采用愈創木酚法、紫外吸收法和氮藍四唑染色法[13],離子含量用電感耦合等離子體原子發射光譜儀測定(Thermo Fisher公司,ICP-AES6300型)。

1.4 數據處理與分析

用 Excel軟件進行數據處理和作圖, 用 SPSS軟件進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對槲樹根莖葉離子含量的影響

總體上,隨著NaCl處理濃度增加以及處理時間的延長,槲樹根和葉中Na+隨之升高,莖中含量則先升后降(圖1)。Na+含量的變化幅度與脅迫濃度呈正相關,在高濃度脅迫第30天時,根系中Na+濃度為對照的3.5倍,莖與葉片中均為對照3倍。根莖葉中Na+含量對比可知,Na+在根系中的含量遠高于莖和葉,300 mmol/L脅迫第30天根系Na+含量分別達到了莖與葉的3倍和2倍。鹽脅迫的加重,導致槲樹根莖葉中K+含量不斷下降。以根系中K+變化最顯著,200 mmol/L脅迫第30天時降幅最大,下降至對照的46%。葉片中K+含量在中低濃度鹽脅迫下無明顯下降,高濃度下則顯著低于對照。隨著NaCl處理濃度的增加以及鹽脅迫時間的延長,槲樹根莖葉中Na+/K+隨鹽脅迫加重而升高,且 Na+/K+由地下向地上部分逐漸降低。根中Na+/K+最大,300 mmol//L脅迫第30天達到對照的6.25倍。

圖1 鹽脅迫下槲樹根莖葉中Na+、K+含量和Na+/K+的變化Fig.1 Changes of Na+, K+ content and Na+/K+ in the roots, stems and leaves of Q. dentata under salt stress小寫字母a、b、c、d、e表示在P<0.05水平上差異顯著

圖2表明,隨著鹽脅迫濃度和時間的增加,槲樹莖葉中Ca2+隨之升高。其在葉片中的漲幅高于莖,莖中Ca2+的變化在鹽脅迫第30天達到顯著水平,其漲幅與鹽脅迫濃度呈負相關。根系中Ca2+含量則隨鹽脅迫加重而不斷降低。300 mmol/L鹽脅迫第30天時根系中Ca2+含量降低至對照的52%。鹽脅迫下,槲樹莖葉中Mg2+含量變化大體為不斷降低,且降幅與鹽濃度呈正相關,尤以莖葉更為顯著。100 mmol/L鹽脅迫第30天,其在根系中有顯著升高,含量為對照的1.22倍。

圖2 鹽脅迫下槲樹根莖葉中Ca2+、Mg2+含量變化Fig.2 Changes of Ca2+ and Mg2+ content in the roots, stems and leaves of Q. dentata under salt stress

2.2 鹽脅迫對槲樹葉片含水量的影響

如圖3,槲樹葉片含水量隨鹽脅迫的進行不斷降低,降幅與鹽濃度呈正相關。低濃度和中等濃度鹽脅迫下分別在脅迫第30天和第20天達到顯著水平,而高濃度鹽脅迫下葉片含水量在不同時間均顯著下降。300 mmol/L處理第30天時,含水量最低降至43.2%,為對照的64.1%。

圖3 鹽脅迫下槲樹葉片含水量的變化 Fig.3 Changes of Water content in the leaves of Q.dentata under salt stress

2.3 鹽脅迫對槲樹葉片膜透性的影響

由圖4可以得出,隨NaCl處理濃度的增加和鹽脅迫時間的延長,槲樹相對電導率和丙二醛含量均呈現出不斷升高的趨勢,其升高均在300 mmol/L鹽脅迫下最為顯著。中高濃度鹽脅迫下,相對電導率在脅迫第20天后顯著升高,第30天時電導率分別比20天增加了0.07和0.19。300 mmol/L處理第30天,丙二醛含量最高為68.85 nmol/g,相對電導率也達到0.54。

圖4 鹽脅迫下槲樹葉片相對電導率、丙二醛含量的變化Fig.4 Changes of Relative conductivity, Malonaldehyde content in the leaves of Q.dentata under salt stress

2.4 鹽脅迫對槲樹葉片抗氧化酶活性的影響

圖5表明,鹽濃度低于300 mmol/L時,槲樹葉片POD無明顯變化；當鹽濃度達到300 mmol/L時,隨著處理時間延長,葉片POD活性表現為先升高,后降低至對照以下。隨NaCl處理濃度的增加,槲樹CAT酶活性增加,當鹽濃度達到300 mmol/L時,葉片CAT活性相較于100 mmol/L和200 mmol/L脅迫時有極顯著提高。在低濃度處理下,隨處理時間延長,CAT活性呈增加趨勢,而在高濃度(300 mmol/L)NaCl處理20天,槲樹葉片CAT活性達最大值,為0.258 U/g,當脅迫時間延長到30天,其活性顯著下降到0.236 U/g。槲樹SOD活性變化規律為鹽濃度低于300 mmol/L時,SOD活性逐漸提高；鹽濃度達到300 mmol/L時,SOD活性極顯著降低,且降幅與脅迫時間呈正相關。200 mmol/L濃度NaCl處理第30天時SOD達到了2035.69 U/g；300 mmol/L濃度NaCl處理第30天時SOD低于對照,為1705.32 U/g。

圖5 鹽脅迫下槲樹葉片過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig.5 Changes of POD, CAT, SOD active in the leaves of Q.dentata under salt stress

2.5 鹽脅迫對槲樹葉片滲透調節物質的影響

可溶性糖和脯氨酸在鹽脅迫下總體表現為不斷積累(圖6)。低于300 mmol/L的鹽脅迫下,槲樹葉片可溶性糖和脯氨酸的積累隨濃度增加并不顯著,隨脅迫時間的延長變化顯著。當鹽脅迫濃度達到300 mmol/L,可溶性糖在脅迫第20天極顯著積累,含量達到了0.162 ug/g,在脅迫達到第30天時積累量減少至0.157 μg/g,但其積累量仍顯著高于對照。300 mmol/L鹽脅迫下,處理第20天和30天可溶性糖含量分別為0.215 μg/g和0.175 μg/g。

圖6 鹽脅迫下槲樹葉片可溶性糖、脯氨酸含量的變化Fig.6 Changes of Soluble sugar and Proline content in the leaves of Q.dentata under salt stress

3 討論

曹磊等發現,槲樹在低濃度鹽脅迫下,生長基本正常,鹽害癥狀不明顯,當用300 mmol/L濃度NaCl處理時,隨時間延長,鹽害逐漸加強,到第30天時,所有葉片均出現焦葉癥狀[4]。本研究所測定的葉片離子濃度、細胞膜透性、抗氧化酶的活性以及滲透調節物質均呈現相應的變化。隨著鹽脅迫的加重,槲樹光合速率、PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ光化學量子產量(Yield)、非光化學猝滅系數(NPQ)呈下降趨勢[4]。冷平生等研究發現,鹽脅迫使黃連木根莖葉中Na+含量升高,離子毒害隨即產生,導致在重度脅迫下存活率僅63%[5]。槲樹在鹽脅迫下大量吸收Na+,重度脅迫下含量達到最高,鹽害癥狀隨之產生,暗示其鹽害癥狀可能與離子毒害相關。NaCl脅迫下槲樹不同組織Na+含量也有差異,其主要集中在根系,地上部分在輕中度鹽脅迫下Na+積累不多,重度脅迫下Na+在根莖葉均顯著積累。在對弗吉尼亞櫟的研究中同樣發現,弗吉尼亞櫟葉片中Na+積累少于根系[14]。王樹鳳認為這是弗吉尼亞櫟主動適應鹽脅迫的機制,是鹽離子的區隔化[15]。本研究尚不能將此定義為槲樹鹽離子的區隔化,這可能只是槲樹通過根系的補償作用,將Na+集中在根部,減少地上部分Na+含量,從而適應鹽脅迫的機制。在北京槲櫟中同樣發現了這一機制,只是其根系的代償能力有限,導致北京槲櫟在0.2%鹽脅迫下根系與葉片Na+含量就達到了同一水平[1]。總之,槲樹與耐鹽性強的弗吉尼亞櫟有較為相似的鹽適應機制,其根系有一定的補償能力,在輕中度鹽脅迫下能有效的減輕地上部分離子毒害,這可能延緩了地上部分鹽害的發生。

鹽脅迫下,植物過量吸收Na+會導致K+、Ca2+、Mg2+的外排與流失[16]。本研究表明,槲樹在吸收Na+的同時,K+、Mg2+隨之外排,尤以K+的外排最為顯著,導致Na+/K+顯著升高。在對大豆(Glycinemax(Linn.)Merr.)[17]、沙棗[18]、青錢柳[10]、槲櫟[1]的研究中也得到相似結果。歐洲落葉松(LarixdeciduaMill.)在鹽脅迫下大量積累Na+和Cl-,K+卻能保持在穩定水平[19]。這與槲樹的結果不一致,二者耐鹽機制不同,歐洲落葉松可能更依賴于維持體內K+水平,以適應高鹽環境。K+參與植物體內多種酶及代謝過程[20],而較高濃度的Mg2+有利鹽生植物蛋白合成酶維持高活性[21]。隨鹽脅迫加重,K+、Mg2+流失增多,會導致槲樹K+和Mg2+依賴性酶的活性不斷降低,從而影響到其參與的代謝反應,并最終影響槲樹的生長。由于根系受到的離子毒害較重,槲樹K+的外排在根系最多,葉片相對較少。輕度鹽脅迫下,Mg2+含量在槲樹根系卻有一定的升高。陳少良等指出,與群眾楊(Populuspopularis‘35-44’)不同,胡楊P.euphraticaOliv)在鹽脅迫下可通過根系吸收土壤中的Mg2+和Ca2+,以維持地上部分營養元素水平[22]。槲樹根系Mg2+小幅升高的同時,莖葉中Mg2+的流失也相對較少,暗示槲樹可能與胡楊相同,能夠通過根系吸收Mg2+,向地上部分運輸,以維持地上部分營養供給。但槲樹根系吸收Mg2+能力有限,鹽脅迫加重后,根系的吸收則不能抵消離子毒害所產生的營養元素流失。槲樹根系中Ca2+含量降低,卻在莖葉中不斷積累,以葉片中積累量最大,這與沙棗[18]和青錢柳[10]的Ca2+流失有所不同。Ca2+在鹽脅迫適應中通常被認為是陽離子穩態的關鍵,在胞質中Ca2+穩態的建立是鹽適應的一個必要條件[23]。槲樹根系Ca2+可能部分轉移至地上,以建立地上部分離子穩態。李廣魯等發現,外源Ca2+促進冰葉日中花根尖Na+外排,抑制K+流失[24]。槲樹Ca2+的向上運輸可能是其穩定地上部分K+、Na+平衡,適應鹽脅迫的重要機制。

槲樹在中低濃度鹽脅迫下,葉片含水量降幅較小,幾乎無鹽害癥狀；高濃度脅迫下含水量顯著降低,葉片嚴重失水皺縮。這是鹽離子濃度過高,破壞了離子平衡,導致水分虧缺所致。大量Na+的積累會產生離子毒害,破壞細胞膜結構,相對電導率和丙二醛含量是反映細胞膜受損程度的重要指標,路斌[25]認為,相對電導率達到50%對細胞膜將有致命損傷。隨著鹽脅迫的加重,槲樹葉片相對電導率和丙二醛含量不斷增大,槲樹細胞膜受損加重,當高濃度NaCl脅迫達到第30天時,膜脂過氧化物丙二醛含量達68.85 nmol/g,相對電導率為0.54,葉片受損嚴重,葉緣焦黃。在對槲櫟[1]的研究中得到相似結果,0.4%—0.6%濃度鹽脅迫下槲櫟相對電導率變化顯著,0.1%—0.3%濃度脅迫下則無明顯變化。李志萍等[3]對栓皮櫟的研究表明,二年生栓皮櫟在0.6%及0.8%濃度鹽脅迫后期,丙二醛含量漲幅顯著增加。槲樹與槲櫟、栓皮櫟相似,對中低濃度鹽脅迫耐受性良好。

鹽脅迫下,細胞代謝失調,產生大量自由基和膜脂過氧化物,植物細胞膜受損,保護酶系統隨即被激活,SOD、POD、CAT等保護酶活性隨之升高,以清除活性氧和過氧化物,在逆境中保護植物免受氧化損傷[26-27]。本研究發現,槲樹主要依靠SOD和CAT兩種酶協同作用清除活性氧。POD活性變化不顯著,僅在重度脅迫下活性降低。這與栓皮櫟[3]的研究結果不同,二年生栓皮櫟在0.6%和0.8%濃度鹽脅迫下,三種保護酶活性均顯著升高。產生差異的原因可能與苗齡有關,二年生幼苗相較于一年生可能在POD的抗氧化能力上有所提升；也可能是兩種櫟樹本身POD的抗氧化能力有所差異,尚需進一步研究。SOD和CAT活性升高,能有效的清除活性氧,使膜脂過氧化程度在較低水平,保證槲樹正常生長。重度鹽脅迫下,三種保護酶先后遭到破壞并逐漸失活,氧代謝紊亂,氧化脅迫最終導致焦葉現象的出現。王瑞剛等對于I-214楊(P.×euramericanacv. I-214.)的研究表明,鹽脅迫下,I-214楊SOD和POD活性下降后,丙二醛含量和電解質外滲率大幅上升,其鹽害癥狀隨即顯現[28],這與本研究結果一致。

可溶性糖和脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質,對保持原生質與環境的滲透平衡起重要作用,其含量與耐鹽性呈正相關[29-30]。Han等[31]發現,鹽脅迫下AtslZ1過表達株擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)耐鹽性優于野生型,是通過促進脯氨酸和可溶性糖的積累實現的。本研究認為,輕中度鹽脅迫下,槲樹可溶性糖和脯氨酸均有小幅積累,對于調節槲樹滲透平衡,以及適應鹽脅迫有所幫助。研究表明,栓皮櫟在高濃度脅迫下脯氨酸和可溶性糖均顯著積累[3],而銳齒槲櫟則無明顯滲透調節物質的積累[1]。櫟類樹種滲透物質的積累情況差異較大,槲樹可能介于二者之間,具有一定的滲透調節能力。綜合離子濃度的研究結果,本研究認為,槲樹的滲透調節可能更依賴于離子穩態的建立,脯氨酸和可溶性糖的積累對槲樹的調節起輔助作用。

綜上,NaCl對槲樹的傷害主要為離子毒害作用,可導致細胞膜透性增大及抗氧化酶系統活性降低,焦葉黃斑等鹽害癥狀隨之產生。其主要依靠Na+在根系的積累和Ca2+向地上部分的轉運,可能通過根系少量吸收土壤中的Mg2+,建立離子穩態,以減輕地上部分離子毒害；通過提高CAT、SOD兩種保護酶活性,以緩解氧化脅迫；小幅積累脯氨酸和可溶性糖,輔助調節滲透平衡。可見槲樹具有一定的耐鹽性,能夠適應200 mmol/L以下的鹽脅迫。由于華北地區平均土壤含鹽量在0.3%左右,最高達到了1.39%[32],低于槲樹所能適應的鹽脅迫濃度,因此在華北平原輕、中度鹽漬化土壤的園林綠化中,可選擇槲樹試用。