龍眼SPL基因家族全基因組鑒定及表達分析

路保順，朱永靜，張舒婷，呂煜夢，李曉斐，宋雨洋，賴鐘雄，林玉玲

（福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

0 引言

【研究意義】SPL（squamosa promoter bindinglike）蛋白是一類參與植物眾多生長發育過程的轉錄因子。龍眼（Dimocarpus longanLour）富含豐富的磷質和維生素，對人的大腦和脾臟具有良好的調節作用[1]。龍眼果實的產量和質量取決于胚胎的發育狀況，因此，鑒定SPL家族基因并研究其在龍眼胚胎發育階段的表達，對龍眼果實質量、產量的改善具有重要意義[2]。【前人研究進展】SPL家族成員均含有一個SBP結構域，其家族成員最先在金魚草（Antirrhinum majus）中被 KLEIN 等[3]鑒定出來，并命名為 SBP1和SBP2。SPL家族成員廣泛參與植物胚胎發育、葉片發育、發育階段轉變、花和果實發育、花青素積累等過程[4]。擬南芥中共有17個AtSPL成員[5]，AtSPL1參與調控擬南芥低磷脅迫反應以及誘導有關磷饑餓基因在根際酸化反應的表達[6]；AtSPL1與AtSPL12雙突變體的花絮對熱脅迫有很高的敏感度，AtSPL1和AtSPL12過表達時明顯增強擬南芥的耐熱性；AtSPL8的突變體會造成花藥變小，花粉囊和花粉數目減少，從而導致不育，主要原因是AtSPL8突變體中花藥某些角隅處孢原細胞無法正常形成造孢細胞和花藥壁層細胞[7]。水稻中共有19個SPL家族成員[8]，OsSPL21的突變導致葉綠素含量顯著下降以及葉片的凈光合速率遠低于野生型，而過表達OsSPL16D可以促進水稻的細胞分裂，改變籽粒的大小和形狀等[9]。前期研究發現SPL蛋白通過與MADS-box的squamosa啟動子結合，對植物花的早期發育進行調控[10]。SPL基因家族在其他物種也有許多研究報道，例如葡萄VvSPL9和VvSPL10在不同組織中均有表達，尤其在營養器官和生殖器官的表達顯著[11]；牡丹PsSPL3在根中轉錄水平較高且響應赤霉素誘導，低溫結合外施赤霉素可以解除花芽內休眠[12]；白樺BpSPL在營養生長和生殖發育生長過程表達有顯著變化，尤其是在頂芽雄花序的生長發育過程中的作用尤為明顯[13]；陸地棉GhSPL10表達趨勢在脫分化前期與胚性再分化過程中完全相反，陸地棉胚性再分化提前發生是因為過表達GhSPL10能提高愈傷的增殖速率[14]。上述研究表明，SPL廣泛參與植物的生長發育等各個進程。【本研究切入點】目前關于龍眼SPL（DlSPL）基因家族系統的分析尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究擬通過生物信息學方法鑒定出龍眼DlSPL所有成員，分析其基本結構特點，并通過qRT-PCR分析DlSPL成員在龍眼胚性培養物及非胚性培養物和不同激素處理下的胚性愈傷組織中的表達情況，為將來進一步研究龍眼DlSPL基因家族成員的生物學功能提供依據。

1 材料與方法

試驗于2019年4—12月在福建農林大學園藝植物生物工程研究所進行。

1.1 材料

試驗材料龍眼非胚性愈傷組織（nonembryonic callus，NEC）、胚性愈傷組織（embryoniccallus，EC）、不完全胚性緊實結構（incomplete embryonic compact structure，ICpEC）、球形胚（globularembryo，GE），脫落酸（ABA，100 μmol·L-1）和茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol·L-1）處理的龍眼 EC[15-16]均由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供，3次生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 龍眼DlSPL家族成員的鑒定 從 GIGADB（http://gigadb.org）中獲取龍眼基因組[17]全長核苷酸序列及氨基酸序列。利用 Pfam從龍眼基因組數據庫中提取所有的SPL家族成員。采用HMMER在線軟件（https://www.ebi.ac.uk/ Tools/hmmer/search/phmmer）對候選序列進行鑒定，篩選獲得具有完整保守結構域的成員。初步鑒定出龍眼DlSPL家族16個候選成員。其中Dlo-026073.2具有重復的保守結構域，另外發現有兩條序列的 CDS序列完全相同，因此刪除冗余序列，最終確定 14個龍眼DlSPL家族成員。把14個DlSPL成員注釋到擬南芥中，并對其命名。

1.2.2 龍眼DlSPL家族系統進化樹的構建 從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載擬南芥的氨基酸序列，采用 MEGA5.0軟件，基于鄰近法（Neighbor-joining method）構建龍眼、擬南芥2個物種SPL家族系統發育進化樹，并用自展法（Bootstrap）重復1 000次進行檢驗。

1.2.3 龍眼DlSPL家族基因結構、蛋白質理化性質及保守基序分析 利用 GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線軟件對龍眼14條SPL基因家族成員進行基因結構分析并繪圖。利用ExPASy和SignalP檢測14條DlSPL氨基酸序列的蛋白的等電點（PI）、分子量（MW）和氨基酸數目（aa）。采用 MEME（http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）對DlSPL家族成員進行保守基序分析。

1.2.4 龍眼DlSPL家族成員啟動子序列的獲得和分析 利用 TBtools軟件，從龍眼基因組數據庫中提取DlSPL起始密碼子ATG上游2 000 bp序列作為龍眼DlSPL的啟動子，利用在線軟件 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）分析其啟動子順式元件的種類和數量。

1.2.5 基于轉錄組的DlSPL家族FPKM值分析 從龍眼非胚性及胚性培養物各階段（NEC、EC、ICpEC、GE）轉錄組、胚性愈傷組織不同激素處理（D：加2,4-D 1.0 mg·L-1的 MS 培養基；D_KT：加 2,4-D 1.0 mg·L-1和 KT 0.5 mg·L-1的 MS 培養基；KT：加 KT 0.5 mg·L-1的MS培養基；MS：MS培養基，瓊脂濃度7 g·L-1，蔗糖濃度 20 g·L-1，MS 作對照）轉錄組及不同光質（藍光、白光，暗處理作對照）處理下轉錄組數據庫[18]中提取DlSPL的基因表達水平（FPKM值），并利用TBtools軟件繪制熱圖。

1.2.6DlSPL家族的 qRT-PCR 分析 采用 TransZol Up試劑盒（http://www.transgen.com.cn/）提取龍眼非胚性培養物、胚性培養物及不同激素處理下胚性愈傷組的總RNA，參照 PrimeScriptTMIV 1st Strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒（https://www.takarabiomed.com. cn/）進行cDNA合成。DlSPL家族成員的qRT-PCR引物序列通過DNAMAN6 進行設計（表1）。qRT-PCR 反應體系（20 μL）包含：10 μL SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）、7.4 μL ddH2O、上下游特異性引物各0.8 μL和1 μL cDNA 模板。反應程序為94℃預變性30 s；94℃變性5 s，退火時間 30 s，72℃延伸 10 s，40個循環。以 Eukaryotic elongation factor 1-alpha （EF-1α）作為內參基因。

表1 qRT-PCR引物序列信息Table 1 qRT-PCR primers of DlSPL in this study

2 結果

2.1 龍眼DlSPL家族成員鑒定及基本理化性質分析

利用Pfam軟件分析其結構域，篩選出14個只含有一個SBP結構域的DlSPL家族成員。在NCBI與TAIR在線網站通過Blast比對，通過注釋到擬南芥和水稻SPL家族，對14個DlSPL成員進行系統命名。

ExPASy和SignalP對DlSPL家族成員基本理化性質鑒定結果顯示（表 2），該家族的氨基酸長度在138—1 062 aa，只有DlSPL1和DlSPL14的氨基酸數大于 1 000 aa。蛋白分子量在 15.61—118.42 kD，其中DlSPL1、DlSPL12和DlSPL14的分子量超過 100 kD。等電點（pI）在5.81—9.22。

2.2 DlSPL基因家族的系統進化樹分析

利用MEGA5.0對17個擬南芥SPL家族成員和14個龍眼DlSPL家族成員的氨基酸序列構建進化樹。參考擬南芥SPL的分類，根據DlSPL同源性分析,可將龍眼DlSPL家族成員分成6大類：第一類：DlSPL2、DlSPL9、DlSPL15；第二類：DlSPL6、DlSPL10、DlSPL13；第三類：DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5；第四類：DlSPL1、DlSPL12、DlSPL14；第五類DlSPL8；第六類：DlSPL7（圖1）。

圖1 擬南芥、龍眼SPL 家族成員系統進化樹Fig. 1 Phylogenic tree of Arabidopsis thaliana and Dimocarpus longan SPL family members

2.3 DlSPL家族基因結構及保守基序分析

龍眼DlSPL外顯子數目在2—10個。進化樹聚集的成員外顯子數目大致相同，例如DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5均含有 2個外顯子；DlSPL6、DlSPL10、DlSPL13均含有 3個外顯子；DlSPL1、DlSPL12和DlSPL14含有10個外顯子；另外，沒有同源聚集的成員中DlSPL8含有3個外顯子，DlSPL7含有10個外顯子（圖2）。

DlSPL共含有10個motif，14個龍眼DlSPL蛋白均有Motif1、Motif2和Motif3（圖3）。Motif5、Motif6、Motif8、Motif9只存在于 DlSPL6和DlSPL10；Motif7和 Motif10只存在于 DlSPL1、DlSPL12和 DlSPL14。另外，在進化樹聚集的成員Motif大多相同，例如 DlSPL2、DlSPL9、DlSPL15的 Motif完全相同；DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5的Motif完全相同；DlSPL6、DlSPL10的Motif完全相同。

2.4 龍眼DlSPL基因家族啟動子元件分析

DlSPL啟動子中含有大量激素應答元件、脅迫響應元件、光反應元件、組織特異性調控元件等（圖4）。對DlSPL所有順式元件及其位點數進行分類和統計發現，DlSPL9是含有啟動子順式作用元件最多的成員；另外，DlSPL10只含有一個anaerobic元件，也是唯一一個不含有光響應元件的成員，提示不同DlSPL成員對光的響應程度可能有差別。

DlSPLs啟動子序列預測到了多個激素響應元件，包括赤霉素、水楊酸、ABA、生長素和 MeJA。含有赤霉素響應元件的有DlSPL1、DlSPL2、DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5、DlSPL7、DlSPL8、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL15；含有水楊酸響應元件的有DlSPL1、DlSPL4、DlSPL6、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL14；含有ABA響應元件的有DlSPL1、DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5、DlSPL6、DlSPL7、DlSPL8、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL15；含有生長素響應元件的有DlSPL1、DlSPL2、DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5、DlSPL6、DlSPL8、DlSPL12、DlSPL14；含有 MeJA響應元件的有DlSPL4、DlSPL5、DlSPL7、DlSPL8、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL14。可見，多種激素參與調控DlSPL的表達，不同成員之間可能存在協同或拮抗作用。

表2 DlSPL家族基本理化性質分析Table 2 Basic parameters analysis of DlSPL family

圖2 DlSPL家族基因結構分布圖Fig. 2 Gene structural distribution map of DlSPL family

圖3 DlSPL家族蛋白motif分布圖Fig. 3 Protein motif distribution map of DlSPL family

圖4 龍眼DlSPL家族啟動子序列順式作用元件分布Fig. 4 Distribution of cis-acting elements in promoter sequence of longan SPL family

DlSPLs啟動子序列同時也預測到了厭氧誘導響應元件ARE、低溫脅迫相關的應答元件LTR、干旱相關的應答元件MBS等響應逆境脅迫的元件。此外還檢測到了許多與植物生長有關的元件例如分生組織表達相關的調控元件CAT-box、參與胚乳表達的Endosperm、以及參與莖特異表達元件Meristem等。上述結果表明，不同響應元件共同調控DlSPL在龍眼中的作用。

2.5 DlSPL家族在不同光質下、不同激素處理以及非胚性及胚性培養物的RNA-Seq表達分析

在不同光質處理的胚性愈傷組織中，除了DlSPL4、DlSPL6、DlSPL10不表達外，其余的11個DlSPLs家族成員均檢測到表達。與黑暗處理對照組相比，11個DlSPL存在3種表達模式（圖5-A）：第一類在藍光和白光處理下呈上調表達趨勢的有DlSPL1、DlSPL2、DlSPL5、DlSPL7、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL14；第二類在藍光、白光處理下呈下調表達趨勢的有DlSPL8；第三類在藍光、白光處理后表達程度與黑暗組相同的有DlSPL3、DlSPL9、DlSPL15。可見，一部分龍眼DlSPL基因家族成員在不同光質處理下表達呈現上調趨勢，極少部分呈現下調表達趨勢。

在不同激素處理的胚性愈傷組織中，同樣除了DlSPL4、DlSPL6、DlSPL10不表達外，其余的11個DlSPL家族成員均檢測到表達。與對照組相比，11個DlSPL存在3種表達模式（圖5-B）：第一類在2,4-D處理下呈上調表達的有DlSPL12、DlSPL14。第二類在 KT處理下呈上調表達的有DlSPL1、DlSPL9和DlSPL14。第三類在 4種處理下表達趨勢相同的有DlSPL5和DlSPL15。由此可見，少部分DlSPL家族成員在激素處理下呈現上調表達趨勢。龍眼DlSPL家族成員在參與激素表達的情況下，對2,4-D和KT兩種激素處理中的一種呈現上調或下調或不表達的情況下，大多數對另一種激素處理呈現出相同的表達結果。

在非胚性及胚性培養物中，有13個DlSPL家族成員均檢測到表達，存在4種模式（圖5-C）：第一類有7個成員在NEC階段表達量最高，其中DlSPL1、DlSPL2、DlSPL5、DlSPL12、DlSPL14在NEC到GE階段表達量先下調后上調；DlSPL3、DlSPL9、在NEC到 GE階段表達量逐漸下調。第二類有 3個成員在GE階段表達量最高，其中DlSPL7在NEC到GE階段表達量逐漸上調；DlSPL13、DlSPL15在 NEC到GE階段表達量先下調后上調。第三類在EC階段表達量最高的只有DlSPL8，并且在NEC到GE階段表達量先下調后上調。第四類DlSPL6和DlSPL10兩個成員在4個階段表達程度幾乎相同。可見，龍眼DlSPL家族成員大部分在體胚發生過程呈下調表達趨勢。

圖5 龍眼DlSPL家族在光質（A）、激素（B）及非胚性培養物和胚性培養物（C）的表達分析Fig. 5 The specific expression of the DlSPL family in light quality (A), hormone (B) and non-embryogenic and embryogenic cultures (C) of longan

2.6 龍眼 DlSPL基因家族成員在非胚性及胚性培養物的中的qRT-PCR分析

除了DlSPL7表達趨勢與轉錄組相同外，其余 4個成員與轉錄組表達趨勢有較所差別（圖6）。其中，DlSPL7呈上升表達趨勢，DlSPL1、DlSPL5、DlSPL13呈先下降后上升趨勢。整體分兩種表現：一是ICpEC階段表達量最高，如DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13。第二種是EC階段表達量最高，如DlSPL1和DlSPL14。

圖6 DlSPL 在龍眼非胚性和胚性培養物中的表達分析Fig. 6 Expression analysis of DlSPL in non-embryonic and embryogenic cultures of Dimocarpus longan

2.7 龍眼 DlSPL家族成員在 ABA和 MeJA處理下的qRT-PCR分析

因DlSPL1、DlSPL5、DlSPL13、DlSPL144 個成員含有至少響應ABA或MeJA其中一種應答元件。因此選用上述4個DlSPL成員探索ABA、MeJA處理0、4、12和24 h的胚性愈傷組織表達情況。qRT-PCR分析結果表明，與0 h對照相比，經ABA處理4、12和 24 h處理后，DlSPL1、DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13均顯著下調表達，可能DlSPL家族在響應ABA元件應答的過程表現出拮抗作用；經MeJA處理4、12和24 h后，DlSPL1、DlSPL7和DlSPL13呈下調表達，其中DlSPL7各時間表達均顯著下調，只有DlSPL5經MeJA 4 h和24 h處理后呈上調表達趨勢，猜測MeJA對DlSPL5在龍眼中的表達有促進作用，并且抑制DlSPL1、DlSPL7、DlSPL13在龍眼中的表達（圖7）。

3 討論

3.1 龍眼DLSPL基因家族成員的分子特性

SPL家族成員參與調控許多植物的胚胎發育、葉片發育、發育轉變階段、花和果實發育、花青素積累等生長發育過程[19]。SPL家族成員的鑒定分析在多種植物中已有報道，但在龍眼中尚未進行詳盡的研究。本研究從龍眼全基因組中鑒定得到 14個具有完整SBP結構域的DlSPL，少于擬南芥（17個）[5]、水稻（19個）[8]、番茄（15個）[20]、銀杏（15個）[21]等物種中SPL基因家族成員數目。DlSPL家族成員的外顯子數目為2—10個，多于三葉裂薯ItSPL成員的2—4個[22]，和菠蘿AcSPL外顯子數目相同（2—10 個）[23]。

系統進化樹結果表明，龍眼DlSPL家族分成6組。同一組成員的基因結構和蛋白保守基序大體相同，具體表現在每一組成員的外顯子數目以及所含Motif種類大致一樣。但也有特殊，例如DlSPL2含有4個外顯子，同組DlSPL9、DlSPL15只有3個外顯子；DlSPL13只含有 Motif2、Motif3、Motif9，同組 DlSPL6、DlSPL10還含有Motif1、Motif5、Motif6、Motif8。在進化樹中關系親近的成員在功能上可能具有相似性，例如，AtSPL8參與植物開花的過程[5]，可以猜測同源性最近的DlSPL8很大可能調控龍眼開花的過程；AtSPL9調控擬南芥由營養生長向生殖生長的轉變，過表達AtSPL9的轉基因擬南芥植株葉片數量減少和葉片遠軸面表皮毛增加[24-27]；在茶樹CsSPL9的研究中發現其可增加茶樹的耐高溫性[28]，這與AtSPL9減少表皮毛數量的作用相似，再根據同源性推斷DlSPL9可能提高龍眼的耐高溫性。

圖7 DlSPL家族成員在ABA和MeJA不同時長處理下的胚性愈傷組織中的表達情況Fig. 7 Expression of DlSPL family members in longan EC treated with abscisic acid and jamonic acid methyl ester for different durations

3.2 DLSPL家族成員可能參與龍眼體胚發生過程

SPL在植物組織特異性表達尤為顯著，8個菠蘿AcSPL成員在花芽、雄蕊、萼片中檢測到表達[15]；小麥TaSPL20不同成員在小麥穗部側芽、雌蕊[29]等部位大量表達，在小麥穗部的發育中起重要作用。SPL家族成員參與調控植物的胚胎發育。在前人的研究中發現柑橘CsSPL14與CsAKIN10互作增強了CsSPL14在柑橘愈傷組織系的體胚發生能力[30]。在銀杏胚胎休眠的3個階段中，少部分GbSPL成員全部呈下調表達模式；另一類GbSPL成員全部呈上調表達模式，總體來說，GbSPL家族在銀杏胚胎發育中的表達水平較高[31]。本研究發現5個DLSPL家族成員可能因為個別基因功能的差異導致其在龍眼 NEC、EC、ICpEC、GE 4個階段的表達模式存在很大差別。大部分DLSPL在 EC、ICpEC階段顯著高表達，在 NEC和GE階段都有下調表達趨勢。不同DLSPL成員在龍眼體胚發育不同階段表達量的明顯差異表現出DLSPL在體胚發育的表達中存在時空特異性。值得注意的是，SPL家族轉錄組測序結果與qRT-PCR結果的表達趨勢并不完全相同，且部分基因存在差異，這可能是由于轉錄組測序時間較早，轉錄組測序所使用的4個階段材料與qRT-PCR試驗的材料為不同批次培養所得，非胚性及胚性培養物狀態可能由于批次效應存在一定的差異，導致表達結果存在差異。今后將通過轉基因驗證試驗來進一步鑒定SPL家族在龍眼體胚發育過程中的功能。

3.3 龍眼DlSPL家族響應ABA和MeJA激素應答

ABA調控許多植物生長的過程。例如ABA能夠緩解鹽分過多對植物造成的滲透斜坡，達到保持水分平衡的目的[32]，脫落酸對水稻產生誘抗效應，顯著提高水稻對堿脅迫的抗性和蘇打鹽堿水田中水稻的產量[33]；胡蘿卜體細胞胚的研究中，適宜濃度的 ABA能使體胚發生提前一周，對其體胚的進一步發育有調節作用[34]。本研究中，4個DlSPL成員的表達經ABA處理后均呈下調表達，而DlSPL1、DlSPL5和DlSPL7均含有ABA的應答元件，進一步說明DlSPL能夠應答ABA的處理；值得注意的是DlSP13雖不含ABA的應答元件，但qRT-PCR結果顯示其也能響應ABA處理并呈下調趨勢，提示其他SPL成員也有可能受ABA調控。前人對SPL的研究發現SPL與植物的開花過程密切相關[35]，ABA 可以加快番茄結實[36]的過程，結合qRT-PCR結果，DlSPL成員可能更多參與龍眼結實前的發育。

MeJA與植物的抗逆能力有著密切聯系，例如干旱脅迫下，外源MeJA可以增強玉米幼苗根系水通道蛋白的表達，提高根系的吸水能力[37]。另外，發現MeJA可以提高紫蘇種子SOD等保護酶的活性，有效降低高溫高濕等逆境對種子造成的氧化和損傷，保證紫蘇種子在高溫高濕脅迫下的正常萌發[38]。最新研究發現濃度1 μmol·L-1左右的 MeJA 能提高雜交鵝掌楸體胚發生率和體胚成熟率[39]。在橡膠樹的研究中發現MeJA是誘導橡膠樹體胚花青素積累的有效誘導劑[40]。qRT-PCR結果顯示只有DlSPL5在MeJA處理后呈上調表達，DlSPL1、DlSPL7和DlSPL13呈下調表達。DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13均含 MeJA 元件，但DlSPL1不含該元件，卻也能響應MeJA處理呈下調表達，提示SPL可能具有復雜的調控關系。

4 結論

本研究共鑒定出DlSPL成員14個，只含有一個高度保守的SBP結構域成員；根據擬南芥AtSPL家族分類標準可把龍眼DlSPL成員分成6大類；多數DlSPL成員在非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織階段高表達；龍眼DlSPL響應ABA和MeJA的應答。