國內外不同產區和類型雪茄煙煙草特有亞硝胺及生物堿含量分析

孫雨琦，趙園園，周迪，鐘秋，王俊，周駿，曾代龍，秦艷青，劉德水，楊興有，李晶晶，陳勇，史宏志

1 河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業煙草栽培重點實驗室/煙草農業減害研究中心，鄭州市金水區文化路95號 450002；

2 四川省煙草公司德陽市公司，四川省德陽市什邡回鎮青雀路30號 618400；

3 上海煙草集團北京卷煙廠有限公司，北京市通州區萬盛南街99號 100024；

4 四川中煙工業有限責任公司長城雪茄煙廠，四川省德陽市什邡經濟開發區華山路南段128號 618400；

5 中國煙草總公司四川省公司，成都市高新區世紀城路936號 600041

煙草特有亞硝胺（tobacco-specifcnitrosamine，TSNA）是煙草生物堿和亞硝酸鹽發生亞硝化反應生成的化合物，在煙葉和煙氣中都有存在，現已證實的有8 種[4]，其中最主要的4 種為N-亞硝基降煙堿（NNN），4-（甲基亞硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK），N-亞硝基假木賊堿（NAB）和N-亞硝基新煙堿（NAT）[5]。有研究表明，NNN 和NNK 具有一定的致癌性和致突變性[6-7]。NNK 又被確定為影響卷煙煙氣危害性最重要的7 有害成分指標之一[8]。因此認為，TSNA 的含量和組成直接影響煙草制品的安全性。史宏志等發現不同產地的煙葉樣品中，白肋煙煙葉的TSNAs 含量最高，香料煙次之，烤煙則遠低于白肋煙和部分香料煙[9]。而目前關于不同產區雪茄煙葉TSNAs 含量和雪茄煙安全性的研究較少，摸清國內外雪茄煙葉中煙草特有亞硝胺的現狀，對于客觀評價和進一步提高雪茄煙葉產品的安全性具有重要意義。

生物堿是形成TSNAs 的主要前體物之一[10]。煙草中生物堿的組成主要有四種，分別為煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿[11]。一般情況下，煙堿占總生物堿含量的94%以上，降煙堿含量低于總生物堿含量的3.5%[12]。然而，煙葉群體中，一些煙株由于發生基因突變而產生煙堿去甲基能力，導致煙堿轉化為降煙堿，造成生物堿組成發生顯著變化，這不僅影響煙葉的香味品質和滿足感，還會因為降煙堿極易與亞硝酸發生亞硝化反應導致亞硝基降煙堿（NNN）和總TSNAs 含量升高[13-15]。關于煙堿轉化方面的研究主要集中在白肋煙上[16-18]，而對于雪茄煙葉生物堿組成的分析及其與煙草特有亞硝胺關系則鮮有報道。國內雪茄煙市場廣闊，但目前仍然處于起步階段[19]。要進一步促進行業雪茄煙高質量發展，應充分考慮雪茄煙葉優質和安全問題。本試驗系統研究了國內外不同產區雪茄煙葉TSNAs、生物堿的含量并對其相關性進行了分析，這對于明析國內外雪茄原料生物堿和TSNAs 的整體水平以及含量差異具有重要意義，以便于后期采取更有針對性的措施降低雪茄煙葉和制品的健康風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗收集了55 個雪茄煙葉樣品，均為各個產區主栽品種于2019 年發酵后的中部葉。試驗過程中對樣品進行分類，其中按產區分為中美洲（多米尼加10 個、古巴8 個）、南美洲（巴西7 個）、東南亞（印尼13 個）、中國（四川德陽6 個、四川達州5 個、海南4 個、湖北來鳳2 個），計為4 個產區；按雪茄類型分為茄芯（29 個）、茄衣（13 個）、茄套（13 個），計為3 種類型。

1.2 化學分析方法

1.2.1 生物堿測定

采用氣相色譜法，將雪茄煙樣品于50℃烘干后粉碎，過250 μm 篩。每樣品稱取200 mg，煙末置于15 mL 旋蓋培養試管中，加入內標溶液（7.5 μg/μL 正十六烷內標溶液）100 μL，10%NaOH 溶液1.5 mL，甲基叔丁基醚3 mL，旋緊旋蓋，充分振蕩5 min 后，室溫放置（24±2）h 后提取上層清液通過Agilent 7890A 型氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（美國Agilent Technologies公司）定量分析4種生物堿（煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿）的含量并以其含量之和作為總生物堿含量。煙堿轉化率（%）=［降煙堿含量/（煙堿含量+降煙堿含量）］×100。

1.2.2 TSNAs 測定

雪茄煙樣品中的TSNAs 由上海煙草集團有限責任公司北京卷煙廠進行測定，采用SPE-液相色譜質譜聯用（SPE-LC-MS/MS）法［SPE-LC：Symbiosis（Pico），Spark Holland（上海儀真分析儀器有限公司）；MS/MS：triplequad5500，ABSciex（上海愛博才思分析儀器貿易有限公司）］。稱取1.0 g 煙樣，置50 mL 錐形瓶中，加入40 μL 的4 種氘代TSNAs（內標）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 的100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下振蕩（200 r/min，萃取60 min），萃取液過0.45 μm 水相濾膜后使用LC-MS/MS 檢測TSNAs 含量（質量分數），NNN、NNK、NAT 和NAB 含量之和為TSNAs 總量。

1.3 數據處理

運用Excel 2010 對原始數據進行標準化處理，運用DPS 7.05 進行相關分析，用LSD 法比較均值差異的顯著性，采用Excel 2007 繪圖制表。

2 結果分析

2.1 雪茄煙生物堿含量及變異

2.1.1 不同產區雪茄煙生物堿含量狀況及變異分析

從4 個產區的生物堿含量來看（圖1），國內外產區的樣品均以煙堿含量最高，為0.66%～10.02%，平均值2.69%；假木賊堿含量最低，均在0.07%以下；降煙堿、新煙草堿含量均在0.80%以下；煙堿轉化率為2.07%～28.01%，平均值7.66%，變化范圍較廣。

由表1 可知，國內外產區之間的樣品降煙堿含量無顯著差異，國內產區樣品的煙堿和總生物堿含量顯著高于南美洲和東南亞；假木賊堿和新煙草堿含量顯著高于國外3 個產區；煙堿轉化率顯著低于南美洲，但與中美洲、東南亞無顯著差異。除中美洲和東南亞產區的假木賊堿以外，各個產區的主要生物堿及總生物堿含量的變異系數均在40%以上，變異性較大。國內外產區雪茄樣品的煙堿轉化率變異系數均在70%以上，且各個產區內均有煙堿轉化率高于15%的雪茄樣品，因此認為雪茄煙葉普遍存在煙堿向降煙堿轉化的問題。

2.1.2 不同類型雪茄煙生物堿含量狀況及變異分析

按雪茄煙類型對生物堿含量進行分析（圖2），茄芯、茄衣、茄套樣品的煙堿含量分別在1.92%～10.02%、0.66%～2.36%、1.03%～2.43%之間，總生物堿含量分別在2.02%～10.90%、0.73%～3.20%、1.30%～2.70%之間，降煙堿、假木賊堿、新煙草堿含量均低于1.00%。各類型雪茄樣品的煙堿轉化率在2.07%～28.01%之間，平均值為7.66%。

結合表2 可知，不同類型雪茄樣品的降煙堿含量無顯著差異，而茄芯樣品的煙堿、假木賊堿、新煙草堿、總生物堿含量均顯著高于茄衣、茄套。茄衣樣品的煙堿轉化率顯著高于茄芯、茄套，而茄芯與茄套間的煙堿轉化率無差異顯著。三種不同類型雪茄樣品的降煙堿及煙堿轉化率變異系數均在60%以上，煙堿轉化率變異幅度較大。

圖1 不同產區雪茄煙生物堿含量Fig. 1 Contents of alkaloids in cigars from different production areas

表1 不同產區雪茄樣品生物堿含量變異情況Tab. 1 Variation of alkaloids contents in cigar samples from different production areas

圖2 不同類型雪茄煙生物堿含量Fig. 2 Contents of alkaloids in different types of cigar samples

表2 不同類型雪茄樣品生物堿含量變異情況Tab. 2 Variation of alkaloid content in different types of cigar samples

2.2 雪茄煙TSNAs 含量及變異

2.2.1 不同產區雪茄煙TSNAs 含量狀況及變異分析從4 個產區的TSNAs 含量來看（圖3），國內外各個產區樣品NNN 的含量為0.63 μg/g ～20.91 μg/g，平均值為4.06 μg/g；NAT 的含量為范圍在0.21 μg/g ～8.64 μg/g，平均值為1.94 μg/g；NAB 和NNK 的含量均在1.30 μg/g以下；總TSNAs 的含量為1.46 μg/g ～25.75 μg/g，平均值為6.47 μg/g。從TSNAs 組成來看，NNN 和NAT所占TSNAs 的比例相對較高，是TSNAs 中的主要成分。

圖3 不同產區雪茄煙TSNAs 含量Fig. 3 TSNAs content of cigars from different producing areas

表3 不同產區雪茄樣品TSNAs 含量變異情況Tab. 3 Variation of TSNAs contents in cigar samples from different production areas μg/g

由表3 可知，國內產區樣品的NNN、NAT、NAB 及總TSNAs 含量顯著低于南美洲，但與中美洲、東南亞無顯著差異。國內產區樣品的NNK 含量顯著低于東南亞，但與中美洲、南美洲無顯著差異。此外，國內外各個產區樣品的NNN、NAT、NAB、NNK 及總TSNAs 含量變異系數均在45%以上，變異幅度較大。

2.2.2 不同類型雪茄煙TSNAs 含量狀況及變異分析

按雪茄類型對TSNAs 含量進行分析（圖4），茄芯、茄衣、茄套樣品的NNN 含量分別在0.63 μg/g～6.52 μg/g、0.66 μg/g～11.95 μg/g、1.02 μg/g～20.91 μg/g 之 間，NAT 含 量 分 別 在0.21 μg/g～5.89 μg/g、0.35 μg/g～8.64 μg/g、0.74 μg/g～4.23 μg/g 之間。從總TSNAs 含量來看，茄芯樣品為1.77 μg/g～10.97 μg/g，平均值4.98 μg/g；茄衣樣品為1.46 μg/g～21.13 μg/g，平均值7.69 μg/g；茄套樣品為2.08 μg/g～25.75 μg/g，平均值8.55 μg/g。

由表4 可知，茄套樣品的NNN 含量顯著高于茄芯樣品，NNK 含量顯著高于茄芯、茄衣樣品；而三種不同類型樣品的NAT、NAB 及總TSNAs 含量均無顯著差異。三種類型雪茄樣品NNN、NAT、NAB、NNK 及總TSNA 含量變異系數均在45%以上，變異幅度較大。

圖4 不同類型雪茄煙TSNAs 含量Fig. 4 TSNAs content in different types of cigar samples

表4 不同類型雪茄樣品TSNAs 含量變異情況Tab. 4 Variation of TSNAs content in different types of cigar samples μg/g

2.3 雪茄煙TSNAs 與生物堿的關系

以煙堿轉化率5%為分界線，將55 個樣品原料大致分為24 個轉化株和31 個非轉化株兩部分，分別對其TSNAs 與生物堿含量進行相關性分析（表5），當煙堿轉化率大于5%或小于5%時，雪茄煙降煙堿與NNN、總TSNAs 均呈顯著正相關關系。當煙堿轉化率小于5%時，煙堿轉化率與NNN、總TSNAs 含量無顯著相關關系；當煙堿轉化率大于5%時，煙堿轉化率與NNN、總TSNAs 含量呈極顯著正相關關系，說明煙葉樣本不同可直接影響TSNAs 前體物對TSNAs 形成的貢獻，煙堿轉化率較高的煙葉，煙堿轉化對TSNAs 形成的貢獻度提高。

3 討論

生物堿是雪茄煙葉核心化學成分，其組成和含量不僅直接影響雪茄煙葉香味品質和生理強度，而且作為煙草中重要的有害物質煙草特有亞硝胺合成的前體物，對雪茄煙葉調制和發酵過程中煙草特有亞硝胺的形成和積累起重要作用，因此，適宜的生物堿含量水平和合理的生物堿組成是優質低害雪茄煙葉生產的必然要求。本試驗表明，國內外不同產區雪茄煙葉和茄芯、茄衣等不同用途雪茄煙葉生物堿含量樣本間差異性均較大，特別是煙堿、降煙堿含量和煙堿轉化率變異性極大，表明雪茄煙葉煙堿向降煙堿轉化問題突出。煙堿轉化導致煙堿含量異常降低，可顯著影響雪茄煙葉香氣呈現和風格特征，降低生理滿足感和醇厚度，同時，由于煙堿去甲基后形成的仲胺類降煙堿極易發生亞硝化反應形成NNN，可造成總TSNAs 水平大幅增加。本研究表明，不同產地和不同用途雪茄煙葉NNN 和總TSNAs 含量的樣本間變異性也均較大，相關分析表明，降煙堿含量與NNN 和總TSNAs 含量呈顯著正相關關系，說明煙堿轉化導致的降煙堿含量增加是目前雪茄煙葉NNN 和總TSNA 含量水平增高的主要原因。

表5 不同分類雪茄煙TSNAs 與生物堿的相關系數Tab. 5 Correlation coefficient between TSNAs and alkaloid of different cigar samples

煙草特有亞硝胺的合成前體物是生物堿和亞硝酸，這兩類前體物的形成受遺傳、栽培和生態因素的綜合影響[13]。從本試驗結果看，雖然不同產地雪茄煙葉的生態條件和栽培技術有較大差異，但生物堿和煙草特有亞硝胺含量的地區間差異相對較小，這可能是因為目前不同產區和不同用途雪茄煙葉存在的主要問題是煙堿轉化性狀的穩定性較差，變異性較大，因而掩蓋了生態條件和栽培管理等方面可能造成的差異，因此，從目前來看，針對煙堿轉化性狀對雪茄品種進行遺傳改良，對生物堿組成進行優化，去除轉化株，降低群體煙堿轉化率是保證和穩定生物堿含量水平，降低煙草特有亞硝胺含量的有效途徑和緊迫任務。在此基礎上，可進一步探究生態環境和栽培、調制技術與煙草特有亞硝胺形成的關系，確定雪茄煙葉進一步增質減害的技術途徑。此外，本試驗對品種分析有一定局限性，因此，可能品種的實質性影響會被掩蓋。下一步我們將在鑒別轉化株的基礎上，選用同一品種的非轉化株進行設計，比如用同一品種的非轉化株系或同一轉化水平的株系在不同生態區進行種植，這樣可以消除煙堿轉化的影響和干擾，更科學地比較和分析生態因素對生物堿和TSNAs 的影響，也可進一步分析不同用途煙葉的真實差異。本試驗也表明，采用煙堿轉化率不同的樣本進行分析，發現煙堿轉化率與TSNA 形成的相關性不盡相同，表明降煙堿對TSNA 形成的貢獻不同，與Cai 等[20]的研究一致。因此，在解決雪茄煙葉煙堿轉化問題后，仍有新的課題值得研究。雪茄煙葉一般采用晾制方式進行調制，而且要需要經過獨特的發酵過程，關于煙葉調制過程中TSNA 的形成機理目前研究的較為清楚[18,21,22]，但在雪茄煙調制過程中TSNA 的形成規律，特別是發酵過程中TSNA 形成機理尚需深入研究。

4 結論

不同產地和不同用途雪茄煙葉生物堿組成和含量、煙堿轉化率樣本間差異性均較大，煙堿向降煙堿轉化是目前雪茄煙葉存在的突出問題。不同產地和用途雪茄煙葉TSNAs 含量總體較高，樣本間差異和變異性較大，雪茄煙葉降煙堿與NNN 和TSNAs 存在顯著的正相關關系。對現有雪茄煙葉品種進行改良，優化生物堿組成，穩定生物堿水平是當務之急，對優質低害中式雪茄煙葉生產至關重要。