白酒糟醅微生物多樣性的研究進展

劉 芳，楊康卓，張建敏，喬宗偉，安明哲，鄭 佳，趙 東

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007)

白酒是我國傳統的蒸餾酒，與白蘭地、威士忌、朗姆酒、伏特加、金酒并稱為世界六大蒸餾酒[1]，白酒是以糧谷類為原料(如高粱、大米、糯米、玉米、小麥等)，以大曲為糖化發酵劑，經發酵、蒸餾、貯存、勾調等工藝制成的蒸餾酒。在傳統固態白酒的釀造過程中，微生物群落呈現復雜的多樣性，對白酒產量、品質以及風味起著至關重要的作用。過去，人們通過培養組學方法對白酒釀造過程中的主要微生物進行分析，通過觀察菌群外觀形態、理化特征和計算菌落數量來確定微生物群落的種類和數量。近年來，隨著生物化學和分子生物學技術的不斷發展，用于白酒發酵過程中微生物多樣性的研究方法層出不窮，運用非培養的生理生化方法與現代分子生物學技術對白酒釀造微生物群落進行更全面而深入的研究，使得人們對白酒發酵過程中微生物動態變化與酒質的關系有了新的認識，為深入了解白酒固態發酵機理提供了基礎數據，為改進生產工藝提供了理論參考。

本文綜述了不同香型白酒糟醅發酵過程中微生物群落多樣性的研究方法，并對研究結果進行綜述，以期為深入分析白酒發酵機理提供新思路。

1 發酵過程中糟醅微生物動態變化規律

白酒的釀造是大曲/大曲+窖泥(濃香型白酒)中龐大的微生物區系以糟醅為能量來源和基質發生有序的消長和能量代謝的過程。糟醅中微生物的組成、分布及其消長規律對白酒產量和品質具有重要影響。研究表明，隨著發酵的進行，糟醅中微生物群落在時空分布具有明顯差異；不同香型白酒由于生產工藝的不同，微生物群落分布及變化規律也各不相同。近年來，國內學者對白酒固態發酵糟醅微生物群落變化規律已經做了大量研究，部分研究結果見表1。

2 糟醅微生物群落研究方法及進展

2.1 傳統培養方法

早期對糟醅中微生物的研究多采用傳統微生物培養方法分離鑒定糟醅中可培養微生物，分析白酒糟醅微生物種群結構，探索功能菌株在發酵過程中的消長變化。喬宗偉等[17]對窖池酒醅中不同空間位置的微生物區系進行了動態分析，初步了解了濃香型白酒窖池酒醅不同層面、不同區域微生物數量的分布及變化趨勢：分離獲得113 株細菌，經16S rDNA 鑒定細菌可分為11 個屬，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)為優勢類群；分離得到92 株酵母菌，經鑒定分為14 個屬，其中復膜孢子酵母屬(Saccharomycopsis)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)在入窖樣中數量非常多，為主要優勢菌；分離得到32 株霉菌類菌株，經鑒定主要有犁頭霉屬(Absidia)、曲霉屬(Aspergillus)等。吳飛等[18]從發酵7 d 的濃香型白酒糟醅中分離得到84 株酵母，經形態學、生理生化與18S rDNA 鑒定將其歸為6 個類群，其中伊薩酵母屬(Issatchenkia)和畢赤酵母屬(Pichia)為優勢類群，巴德利酵母屬(Debaryomyces)和假絲酵母屬(Candida)也占有一定的比例。張霞等[19]從貴州濃香型白酒窖泥和糟醅中分離到477株細菌，經鑒定地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)占總芽孢桿菌數的32.96 %，為芽孢桿菌屬優勢類群，同時還分離得到極少量的短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的不確定種菌株。將研究結果與四川濃香型白酒細菌群落比較，發現微生物類群相似。孫劍秋等[20]對醬香型北大倉酒醅中霉菌多樣性進行分析，從酒醅樣品中分離得到328 株霉菌，經鑒定分屬于13屬23種，其中曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)霉菌的數量較大，鏈格孢(Alternaria)、地霉(Geotrichum)、曲梗霉(Geniculosporium)、帚霉(Scopulariopsis)、葡萄穗霉(Stachybotrys)和毛霉(Mucor)等在酒醅發酵某個階段的相對豐度在10 %以上。王薇等[21]運用WL 鑒別培養基和26S rRNA D1/D2序列分析方法對清香型白酒酒醅發酵過程中酵母菌群落進行分析，從清香型白酒固態釀造過程中共鑒定出10 種酵母，發酵前期優勢酵母菌為孢漢生酵母(Hanseniaspora osmophila)與膜璞畢赤酵母(Pichia membranifaciens)，發酵后期優勢酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。曾馳等[22]從白云邊酒高溫堆積酒醅中分離得到6 株不同細菌，根據16S rDNA 序列進行系統發育分析，發現芽孢桿菌屬(Bacillus)為主要的細菌。

表1 不同香型白酒糟醅微生物變化規律

雖然傳統培養法是獲得有益微生物的唯一途徑，但是自然界中僅有不到1%的微生物可培養[37]，采用傳統微生物分離鑒定方法分析白酒糟醅微生物多樣性存在一定的局限性，同時傳統培養法的培養環境與微生物原位生長環境存在巨大偏差，無法完全真實反映發酵過程中環境的脅迫、微生物之間的相互關系，尤其是培養基對微生物的生長的選擇性。

2.2 免培養生理生化方法

2.2.1 PLFA法

磷脂脂肪酸(PLFA)圖譜分析法是一種研究微生物群落結構的快捷方法，主要用于微生物生物量的評價，該方法快速、簡便、重現性好，因而被廣泛應用于土壤[23]、淤泥[24]及窖泥[25]等復雜體系中微生物群落分析[26]。

鄭佳等[27]對不同窖齡濃香型白酒窖池PLFA 分析，結果表明，不同窖齡窖池中的微生物群落結構呈現較為顯著的差異，5 年窖窖泥、糟醅和黃水中真菌PLFA含量均高于其他窖齡相應樣品。徐澤江等[28]應用PLFA 分析方法對芝麻香型白酒堆積過程微生物生物量和群落結構進行分析，結果顯示，整個堆積過程，PLFA 的種類和數量呈現一定的變化規律，其中優勢PLFA 為直鏈飽和脂肪酸和偶數碳不飽和脂肪酸。細菌是整個堆積過程的優勢微生物菌群，革蘭氏陰性菌是細菌中的優勢菌群。鐘姝霞等[29]從醬香型白酒中分離篩選出5株產香芽孢桿菌，經PLFA 鑒定分別為：蠟樣芽孢桿菌(Bacillus ereus)、泛酸枝芽孢桿菌(Virgibacillus pantothenticus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。劉琨毅等[30]的研究結果顯示，基于指紋圖譜能夠表征糟醅微生物群落結構特征及動態變化，對多家釀酒企業糟醅PLFA 組成的檢測結果證實該法在白酒糟醅中應用的普適性。

2.2.2 Biolog微平板分析法

Biolog 技術是由Biolog 公司開發的一種自動化鑒定微生物群落的技術。其測定原理為：微生物在利用碳源過程中產生的自由電子，與四唑鹽染料發生還原顯色反應，顏色的深淺反應微生物對碳源的利用程度[31]。由于該方法靈敏度高、分辨率強、自動化標準化程度高等優點，被廣泛應用于微生物功能及群落多樣性研究[32-34]。李光輝等[35]采用Biolog 平板法對濃香型白酒糟醅微生物群落代謝特性進行研究，結果表明，發酵過程中，下層糟醅微生物群落代謝活性呈先降后升的變化趨勢，微生物功能多樣性的增加與pH 值的顯著降低之間存在著重要聯系。陳林[36]采用Biolog 微平板培養法對醬香型白酒發酵階段微生物群落進行分析，結果顯示，微生物活性隨培養時間的延長而提高。

Bolog微平板法應用于白酒發酵過程中微生物多樣性分析，為了解微生物發酵過程中微生物多樣性提供了快速有效的手段，但該方法具有一定的局限性：僅能鑒定快速生長的微生物，而且測定結果受多種因素的影響。

2.2.3 FISH法

熒光原位雜交(FISH)技術是一種非放射性原位雜交技術，其原理是以熒光標記的核苷酸單鏈為探針，基于堿基互補配對原則，探針與未知的單鏈核苷酸序列進行特異性結合形成雜交雙鏈，使用光密度測定法直接比較核酸雜交條帶或斑點從而獲得定量結果。FISH 技術可進行樣品的原位雜交，已成功運用于非培養微生物的檢測以及細菌群落的多樣性分析[37-38]。該技術也被應用于白酒發酵過程中微生物群落多樣性研究。Li 等[39]結合磷脂乙醚油脂(PLEL)/PLFA 分析與熒光原位雜交技術對濃香型白酒不同窖齡窖泥、糟醅及黃水細菌和真細菌群落進行定量分析，并采用變性梯度凝膠(PCRDGGE)進行定性分析，結果表明，窖泥、糟醅及黃水三相中微生物群落差異顯著，厭氧菌和革蘭氏陽性菌為主要菌群；微生物群落之間的相互作用，特別是真菌群和產甲烷菌群之間的相互作用，在白酒發酵過程中起著關鍵作用。

2.3 基于PCR的指紋圖譜法

2.3.1 DGGE技術

變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術是分子生物學分析中常用的方法之一，其原理是利用丙烯酰胺凝膠中變性劑梯度，使片段長度相同但堿基組成不同的PCR 產物得到分離。凝膠上DNA 條帶數量及強度反映微生物群落的多樣性，通過將切膠回收所得條帶序列與DGGE 指紋圖譜對比分析，最終獲得樣本微生物群落結構的整體信息。由于該技術具有準確、高效、檢測限低等優點，被廣泛應用于環境微生物群落結構分析。在白酒研究領域，DGGE 技術也被廣泛應用于白酒發酵過程中微生物群落多樣性研究，Zhang 等[40-41]對濃香型白酒發酵過程中真菌及細菌多樣性進行分析，結果發現，發酵過程中伊薩酵母屬(Issatchenkia)、踝節菌屬(Talaromyces)曲霉菌屬(Aspergillus)為主要優勢真菌，同時，隨著發酵的進行，糟醅細菌多樣性下降，其中耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)在發酵過程中為優勢微生物。李德林等[42]研究了濃香型白酒糟醅微生物群落結構發現，濃香型白酒糟醅中檢出細菌18個屬，首次檢出Dyadobacter屬、Pantoea屬、Pediococcus屬、Saccharomonospora屬、Bavariicoccus屬、Serratia屬、Petrimona屬、Exiguobacterium屬菌株；對DGGE 圖譜相似性的分析結果顯示，樣本圖譜間相似性指數較低，季節及水質等因素對微生物群落結構具有較大影響。Chen 等[43]從醬香型白酒糟醅中鑒定出7 種絲狀真菌，其中P.variotii與A.oryzae具有較強的產淀粉酶能力。譚映月[44]研究了醬香型白酒發酵過程中糟醅細菌多樣性，發現芽孢桿菌屬(Bacillus)和乳桿菌(Lactobacillus)為發酵過程中優勢微生物。徐瑾等[45]對清香型白酒細菌多樣性進行研究并優化了PCR-DGGE條件。Wang等[46]采用DGGE 與16S rRNA 克隆文庫方法對比研究了濃香型和芝麻香型白酒酒醅在發酵過程中的微生物菌群結構，DGGE 圖譜發現，糟醅中微生物多樣性隨發酵不斷降低，發酵后期Lactobacillus manihotivorans成為優勢菌群；16S rRNA 克隆文庫發現，濃香型和芝麻香型酒醅中的微生物種屬差異較大。

2.3.2 熒光定量PCR技術

熒光定量PCR 技術，是指在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR 進程，分析擴增循環產物的熒光信號，最后通過標準曲線定量分析樣品模板，推斷目標基因的初始量[47]。該方法具由靈敏度高、準確性高、特異性強、安全快速等優點[48]被廣泛應用于微生物生態學研究。路虎等[49]發現，該方法能夠對白酒固態發酵過程中產土味素鏈霉菌進行定量分析。黃丹等[50]對白酒發酵糟醅耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)與東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)進行分析，結果發現，發酵中期這兩種微生物數量均高于發酵后期，在同一發酵期，靠近窖壁的數量高于窖內。陳筆等[51]以白酒釀造中常用的塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)為例，建立一套快速準確定量塔賓曲霉生物量的方法。孫超等[52]利用該技術及預測微生物學建立可培養釀酒微生物資源數據庫和預測微生物學數學模型。

2.3.3 SSCP技術

單鏈構象多態性（SSCP）技術的原理是：相同長度的單鏈DNA 因堿基序列的不同，形成的構象有所差異，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，不同的DNA 單鏈即可形成分離的條帶。該技術在白酒發酵過程中的微生物群落研究中被廣泛應用[53-55]。馮治平[56]對濃香型白酒酒醅發酵過程中古菌群落進行研究，結果顯示，酒醅中古菌的SSCP圖譜具有較高的相似性指數，表明古菌群落在發酵過程中的變化較小。海娜[57]對濃香型白酒糟醅原核微生物群落進行分析，獲得的SSCP 圖譜條帶介于11～19條，不同發酵時間的原核微生物群落具有較大差異。

PCR-SSCP 技術在研究微生物群落及評價微生物結構變化具有直觀、方便的優點，實驗過程中只需普通引物實驗設備簡單操作簡單。但SSCP圖譜分析結果與群落實際結構存在一定誤差，這主要是基因組DNA 提取方法與PCR 選擇性放大造成的偏差，另外，該技術檢測的靈敏度與DNA 片段長度有關，片段度增加靈敏度降低[58]。

2.3.4 T-RFLP技術

末端限制性片段長度多態性（RFLP）作為第一代分子生物學標記，其原理為：不同生物體或種群間DNA 片段酶切位點不同，DNA 限制性內切酶具有識別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能，利用限制性內切酶進行消化，可得到長短、種類、數目不同的限制性片段。該基于RFLP 技術發展而來的T-RFLP 技術被廣泛應用于群落結構及多樣性分析[59]。T-RFLP 技術用熒光引物對引物一端進行標記，僅需分析被標記的末端限制性片段，根據檢測到的帶有熒光標記的DNA 片段與已有數據庫進行比對，從而判斷樣本微生物多樣性，根據熒光強度的強弱能夠確定物種的豐度。由于該技術具有重復性好、分辨率高，且能對物種豐度進行分析，被廣泛應用于發酵食品微生物多樣性研究[60-61]及白酒大曲、糟醅多樣性研究。Wu 等[62]研究了茅臺糟醅發酵過程中的酵母群落，發現拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、膜璞畢赤酵母(Pichia membranifaciens)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)存在于整個發酵過程中，是發酵過程中的優勢菌群；發酵過程中各層酵母菌數量明顯不同，主要表現為上層酵母菌總數大于中下層，且酵母菌數量與還原糖減少量及乙醇生成量具有明顯的相關性。

2.4 高通量測序技術

高通量測序技術，又稱“第二代”測序技術，是現今應用最廣泛的測序技術，該技術能一次并行測定幾十萬到幾百萬條DNA 分子序列，且一般讀長較短，能夠深入、細致全貌的分析一個物種的轉錄組和基因組。2005 年，454 Life Science 公司首先推出了基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統，開創了第二代測序技術的先河，但由于其通量低、成本高等缺點，目前已退出市場。隨著對測序技術的改進，Illumina 公司與ABI 公司相繼推出了Solexa和SOLID 測序技術占據主流地位[63-64]。近年來，高通量測序技術被廣泛應用于發酵食品菌群多樣性研究[65-66]，同時，越來越多的研究者將這一技術應用于白酒釀造過程中微生物多樣性的研究。Wang 等[67]采用16S rRNA 擴增子測序技術分析了糟醅、窖泥和大曲中的原核生物群落，結果表明，大曲中微生物對糟醅發酵的影響主要表現為發酵前期，窖泥中微生物對發酵糟醅的作用存在于整個發酵過程中；大曲、糟醅及窖泥中共鑒定出299 個屬，以乳酸菌屬(Lactobacillus)、白串珠菌屬(Leuconostoc)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、石化菌屬(Petrimonas)、梭菌屬(Clostridium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、甲烷菌屬(Methanobacterium)和甲烷桿菌屬(Methanobrevibacter)10 個屬為主。Huang等[68]采用454焦磷酸測序技術對濃香型白酒和醬香型白酒發酵過程中細菌與真菌微生物多樣性、功能進行綜合分析，分別從醬香型中鑒定出細菌315屬、真菌72 屬，從濃香型中鑒定出細菌83 屬、真菌47屬；使用PICRUSt軟件對發酵過程中細菌群落功能進行預測，選擇豐度前50 的代謝通路進行分析，預測結果顯示，濃香型白酒糟醅與醬香型白酒糟醅在能量、碳水化合物、氨基酸的代謝通路上具有明顯差異。表2 列舉了部分高通量測序技術在白酒糟醅微生物多樣性研究中的應用。

表2 高通量測序技術在白酒糟醅微生物多樣性研究中的應用

3 展望

白酒釀造過程中，微生物群落的多樣性直接關系到白酒的品質與風味。近年來，隨著生物學技術的快速發展，使人們對白酒釀造過程中微生物多樣性有了更加深入的了解。現階段，對于白酒糟醅微生物群落多樣性及發酵過程中風味物質變化規律已有大量報道，其中涉及微生物群落結構解析與風味物質關聯的研究一直是白酒研究的一個重要領域，但至今仍沒有形成一個完備的理論支撐體系。應用現代分子生物學及培養組學理論技術探究白酒釀造過程中微生物多樣性及生理功能，并結合風味代謝組學進一步深入分析風味物質形成機理，從而科學指導白酒釀造，提高白酒優質品率等，這無疑將是我國白酒研究的重要途徑之一。