酒中吖啶含量檢測方法的比較研究

鄧 依，袁 月，張瀟月，張 雪，劉路宏

（四川宜賓五糧液集團公司質(zhì)量檢測中心，四川宜賓 644007）

吖啶（Acridine）及其衍生物是現(xiàn)代工業(yè)中常用的有機染料和高級顏料[1]。吖啶通常為無色固體，易溶于酒精等有機溶劑，分子式為C13H9N，主要產(chǎn)自石油精餾過程[2]。吖啶為含氮(N)的雜環(huán)化合物，其分子中含兩個苯環(huán)和一個吡啶環(huán)，為偏平式分子結(jié)構(gòu)，可螯合進DNA 分子的堿基對從而引起基因突變[3]。吖啶及其衍生物因其獨特的顏色性能和不含重金屬的特點，在食品安全日益被消費者關(guān)注的今天，廣泛用于染料行業(yè)、顏料行業(yè)，在食品周邊如食品包裝等行業(yè)逐步取代傳統(tǒng)的有機染料和有機顏料[4-6]。酒在其生產(chǎn)過程中存在接觸吖啶類有機染料和有機顏料的可能性，從而存在被吖啶類有害物質(zhì)污染的可能[7]。

目前對酒中吖啶含量檢測的分析方法較少，目前主要有液相色譜-熒光法[8]，另外本研究開發(fā)出用于檢測酒中吖啶含量分析的液相色譜-紫外吸收法和液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法。本文分別從靈敏度、準確度、精密度和樣品加標回收等方面對3 種分析方法的可行性和實用性進行比較研究，為檢測實驗室選擇合適的分析方法提供選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：來源主要有啤酒、雞尾酒、果酒、黃酒、葡萄酒、白酒，均購自當?shù)厥袌觥?/p>

試劑及耗材：甲醇為色譜級，德國Merck 公司；乙酸為ACS 級試劑，北京百靈威科技有限公司；甲酸為LC/MS 級，美國ThermoFisher 公司；乙醇為色譜級，德國Merck 公司；實驗用水為超純?nèi)ルx子水；吖啶標準物質(zhì)為，純度98%，上海阿拉丁試劑有限公司。

儀器設(shè)備：液相色譜儀（MultiMate 3000 標準四元系統(tǒng)，熒光檢測器，Chromeleon 7.0 數(shù)據(jù)處理軟件）美國ThermoFisher 公司；液相色譜儀（Multi-Mate 3000 標準四元系統(tǒng)，紫外吸收檢測器，Chromeleon 7.0 數(shù)據(jù)處理軟件）美國ThermoFisher公司；液相色譜-單四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（MSQ-plus，Chromeleon 6.0 數(shù)據(jù)處理軟件）美國ThermoFisher公司；QUINTIX224 型電子分析天平，德國SI Analytics 公司；INTEGRAL 3 型純水機，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相色譜-熒光法

1.2.1.1 樣品制備

白酒、葡萄酒、果酒、黃酒等不含氣體酒樣直接過0.22 μ m 孔徑的有機系微孔濾膜過濾，即為待測液，可直接進樣分析或用去離子水稀釋后進樣分析；啤酒、雞尾酒等含有氣體的酒需用超聲法除去溶解二氧化碳后，再過0.22 μ m 孔徑的有機系微孔濾膜過濾便為待測液體，可直接進樣分析或用去離子水稀釋后進樣分析。

1.2.1.2 儀器分析方法

色譜柱：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μ m）；流動相，甲醇∶水（含乙酸0.1 %）為80∶20；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μ L；熒光激發(fā)光波長：248 nm，熒光發(fā)射波長447 nm，流通池溫度45 ℃，采用外標法定量。

1.2.2 液相色譜-紫外吸收法

樣品處理方法同1.2.1.1，色譜柱、流動相、流速、柱溫、進樣量同1.2.1.2；紫外吸收波長為248.1 nm、356.0 nm、208.7 nm，采用外標法定量。

1.2.3 液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法

1.2.3.1 樣品制備

白酒樣品經(jīng)0.22 μ m 孔徑的有機系微孔濾膜過濾即為待測液；取葡萄酒、果酒、黃酒等不含氣體酒樣品5 mL 于離心管中，并加入5 mL 乙醚密封后渦旋振蕩萃取2 min，并于4 ℃下以15000 r/min 的速度離心5 min，取上清液2 mL，氮氣吹干后加入2 mL 甲醇溶解，經(jīng)0.22 μ m 孔徑的有機系微孔濾膜過濾即為待測液；啤酒、雞尾酒等汽酒需先超聲除氣后再進行上述萃取步驟，即為待測液。以上待測液可直接進樣分析或用去離子水稀釋后進樣分析。

1.2.3.2 儀器分析方法

色譜條件：色譜柱：C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μ m），流動相為甲醇+水（含甲酸0.1%）為80+20，流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量5 μL；質(zhì)譜條件：采用ESI 離子源正模式掃描，Cone 電壓為50 eV，探針溫度為400 ℃，特征離子為180 Da，采用外標法定量。

1.2.4 計算方法

靈敏度：在最低濃度標準品的色譜圖上，以標準峰保留時間為中心，保留時間跨度為2 min 的范圍內(nèi)尋找最大的噪聲峰，以該噪聲峰峰高的3 倍除以最低濃度標準品峰的峰高，乘以該標準品濃度，為該法吖啶的最低檢測濃度，即該檢測方法的靈敏度[9]。

準確度：以體積比為1∶1 的乙醇水溶液為基體，配制已知濃度的樣品，分別用3 種檢測方法分析每份配制樣品中吖啶的濃度，進行2 次平行試驗，取2 次平行試驗的平均值即為檢測值，檢測值與配制濃度差值的絕對值與配制濃度的比值應(yīng)小于10%。

精密度：取一種酒樣品為基體配制已知濃度的樣品，分別用3種檢測方法進行分析配制。

樣品中吖啶的濃度，進行6 次獨立試驗，計算6次檢測結(jié)果的相對標準偏差RSD，RSD 應(yīng)小于10%。樣品加標回收：取6種酒樣品各3份，分別添加低、中、高3 種不同濃度的標準品，用3 種檢測方法分別測定原樣以及加標樣品中吖啶的濃度，并分別計算加標回收率。樣品回收率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的線性相關(guān)性

液相色譜-熒光法中樣品未進行復(fù)雜處理，基本屬于直接進樣模式，故標準品基體選擇50 %乙醇水溶液，檢測過程中發(fā)現(xiàn)熒光檢測器定量法靈敏度較高，當進樣量為2 pg～2 ng 時有良好的線性關(guān)系，最終配制的工作溶液為0.1 μ g/L，1.0 μ g/L、

10.0 μ g/L、20.0 μ g/L、50.0 μ g/L、80.0 μ g/L、100.0 μ g/L。線性回歸方程中Y 為熒光強度，X 為樣品中吖啶的濃度（μ g/L）。

液相色譜-紫外吸收法基本儀器條件同液相色譜-熒光法，采用DAD 檢測器，分別采用了吖啶紫外吸收圖譜中3 個吸收峰處的紫外波長（208.71 nm、248.15 nm、356.05 nm）作為檢測波長進行標準曲線繪制，發(fā)現(xiàn)以248.15 nm 和356.05 nm作為檢測波長時，標準工作液的吸光度與樣品中吖啶的濃度呈良好的線性關(guān)系，其中采用248.15 nm作為檢測波長時，當進樣量為200 pg～200 ng 區(qū)間均有良好的線性關(guān)系，線性范圍較寬，最終配制的工作溶液為10.0 μ g/L、50.0 μ g/L、100.0 μ g/L、150.0 μ g/L、200.0 μ g/L、250.0 μ g/L、300.0 μ g/L。線性回歸方程中Y 為吸光強度，X 為樣品中吖啶的濃度（μ g/L）。

在質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)吖啶分子結(jié)構(gòu)較為溫度，不容易碎片化，故僅可采用母離子為特征離子。在液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法中吖啶的離子強度與樣品中吖啶的濃度僅在進樣量為50～500 pg區(qū)間線性關(guān)系良好，線性范圍較窄，最終配制的工作溶液為10.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L、400.0 μg/L、600.0 μg/L。線性回歸方程中Y為180 Da離子的強度，X為樣品中吖啶的濃度（μ g/L）。

3 種檢測方法中，液相色譜-熒光法靈敏度最高，液相色譜-熒光法和液相色譜-紫外吸收法線性范圍較寬，而液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法線性范圍最窄，如表1。

2.2 3種方法的檢出限

在最低濃度標準品的色譜圖上，以標準峰保留時間為中心，保留時間跨度為2 min 的范圍內(nèi)尋找最大的噪聲峰，以該噪聲峰峰高的3 倍除以最低濃度標準品峰的峰高，乘以該標準品濃度，為該法吖啶的最低檢測濃度，即該檢測方法的靈敏度。

3 種方法的檢出限均由3 倍噪聲處對應(yīng)的目標物濃度進行計算，根據(jù)計算公式QL=3Sn*C1/S1，其中QL為檢出限，Sn為目標物色譜/質(zhì)譜峰附近最高噪聲峰的響應(yīng)值，C1 為標準曲線最低點對應(yīng)的吖啶濃度，液相色譜—熒光法中為0.1 μ g/L，液相色譜—紫外吸收法中和液相色譜—單四級桿質(zhì)譜法中均為10 μ g/L，S1為標準曲線最低點的響應(yīng)值。3種方法的檢出限分別為0.083 μg/L、2.2 μg/L、4.7 μg/L，見表1。

表1 3種檢測方法的標準曲線及檢出限

2.3 準確度試驗（表2）

從表2 數(shù)據(jù)可見，3 種檢測方法測定的相對誤差分別為-1.1%、9.0%和-9.3%，均滿足絕對值不高于10%的要求，3 種檢測方法的準確度滿足測量要求，且液相色譜-熒光法準確度高于另外兩法。液相色譜-紫外吸收法為正偏離，液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法為負偏離，二者準確度相當。

2.4 精密度試驗（表3）

精密度試驗結(jié)果如表3所示。由表3可見，3種檢測方法的相對標準偏差均小于10 %，滿足測量要求。其中液相色譜-熒光法與液相色譜-紫外吸收法精密度較好，均小于5%。

2.5 樣品加標回收試驗（表4—表9）

表4—表9 為6 種不同酒樣品的加標回收試驗結(jié)果。從表中數(shù)據(jù)可見，液相色譜-熒光法的樣品加標回收率為80 %～118 %，平均回收率為95 %，低、中、高濃度的加標回收率分別為91 %、97 %和96%；液相色譜-紫外吸收法的樣品加標回收率為42 %～102 %，平均回收率為81 %，低、中、高濃度的加標回收率分別為66 %、86 %和91 %；液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法的樣品加標回收率為68 %～92%，平均回收率為82%，低、中、高濃度的加標回收率分別為76 %、84 %和85 %。在低濃度的加標回收試驗中液相色譜-熒光法高于其他二法，而液相色譜-紫外吸收法對低濃度的加標回收率最低，平均不足70 %。液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法加標匯率較穩(wěn)定，但最高只有92%，考慮到因前處理過程中損失所致，可采用內(nèi)標法解決加標回收率偏低的問題。

表2 3種檢測方法的準確度

表3 3種檢測方法的精密度

表4 葡萄酒樣品加標回收試驗結(jié)果

表5 果酒樣品加標回收試驗結(jié)果

表6 黃酒樣品加標回收試驗結(jié)果

表7 啤酒樣品加標回收試驗結(jié)果

表8 雞尾酒樣品加標回收試驗結(jié)果

表9 白酒樣品加標回收試驗結(jié)果

表10 3種酒中吖啶含量測定方法的比較

由表4—表9 可看出，3 種方法對于白酒的加標回收率普遍良好，優(yōu)于其他5 種樣品。以上6 種樣品中僅白酒為蒸餾酒，且為無色飲料。而對于含糖量較高的果酒和雞尾酒普遍加標回收率較低。從而初步懷疑樣品中的色素和糖類物質(zhì)對目標物的檢測有一定影響。

2.6 3種方法檢測結(jié)果對比

本研究對酒中吖啶含量的3 種不同檢測方法進行了對比研究，比對的結(jié)果如表10 所示。結(jié)果表明，液相色譜-熒光法靈敏度較高，變異系數(shù)、相對誤差以及加標回收率均滿足要求。液相色譜-熒光法靈敏度較高，樣品前處理過程較為簡單，在準確度、精密度和加標回收方面表現(xiàn)優(yōu)秀，試驗中使用過的樣品種類暫未發(fā)現(xiàn)有干擾物存在，適合作為權(quán)威檢測方法，但在葡萄酒樣品檢測方面精準度略差。同液相色譜-熒光法相比，液相色譜-紫外吸收法相同的簡易前處理和較短的單樣分析耗時，但在低濃度樣品檢測方面效果較差，檢測設(shè)備價格也更便宜。此二法均適合進行大批量檢測和快速篩查工作。液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法在各方面稍微遜于另外兩種方法，單樣消耗時間也較長，但不受限于樣品種類，對于深色樣品也有較好的加標回收率，且定性效果更準確，適合對篩查的陽性樣品進行精準定性。

3 結(jié)論

由此可以看出，液相色譜-熒光法、液相色譜-紫外吸收法和液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法在測定酒中吖啶含量時，方法的準確性，精密度和加標回收率均能滿足檢測需求，每種方法均有自己的優(yōu)勢。在實際應(yīng)用中，實驗室可根據(jù)實際檢測需求進行選取合適的分析方法。