阿魏酸藜麥淀粉酯Pickering乳液的制備及其抗氧化特性

肖志剛,張依睿,陶莉偉,王妍文,李 響,徐彩紅,張權峰,楊慶余(沈陽師范大學糧食學院,遼寧沈陽 110034)

Pickering乳液是由吸附在不相容的兩相界面上的固體顆粒穩定的乳液[1]。與傳統的表面活性劑相比,Pickering乳液因具有界面穩定性高、抗奧氏熟化、安全性好等優點而廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等領域[2-4]。食品基顆粒如蛋白質、脂肪、碳水化合物等均是食品級Pickering乳液顆粒乳化劑的主要原料[5]。本研究選擇的原料藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)屬于藜科植物,其營養和食用價值超過多數谷物,因此被國際營養學家們稱為“超級谷物”、“未來食品”,還被素食愛好者奉為“素食之王”,備受消費者的歡迎。淀粉分子結構中含有多個羥基,親水性較強[6],因此藜麥淀粉需要通過辛烯基琥珀酸酐(ocentyl succinic anhydride,OSA)疏水改性來獲得較好的親水疏水平衡能力,增強藜麥淀粉顆粒疏水特性,使其在油水界面具有良好的吸附特性,提高乳液的穩定性[7]。阿魏酸(Ferulic Acid,FA)是植物界普遍存在的酚酸之一,廣泛分布于水果、蔬菜和中草藥材中,很少以游離態存在,易與細胞壁多糖或木質素酯化構成細胞壁的一部分[8]。阿魏酸具有多種生物活性,如抗氧化、清除自由基、抗冠心病、預防血栓等[9]。傳統乳液因不具備功能特性,抗氧化穩定性不強[10-11],以及油相脂肪酸極易發生氧化酸敗,引起乳液的營養成分損失[12]。因此,構建一種功能性Pickering乳液具有較為廣闊的應用前景。

目前針對Pickering乳液,研究較多的是穩定機理及乳液界面結構[13],而對具有特殊功能型的Pickering乳液的研究較少。因此,本實驗選取具有抗氧化性的阿魏酸和辛烯基琥珀酸酐對藜麥淀粉進行雙酯化改性,通過測定紅外光譜、X-射線衍射等對不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯的結構進行表征。系統研究阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的結構和抗氧化特性等,揭示阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的機理和抗氧化活性,為充分發揮藜麥淀粉功能,提高藜麥淀粉利用率,制備具有良好抗氧化功能的Pickering乳液奠定理論基礎,對構建抗氧化型Pickering乳液基食品體系具有一定的理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥 青島和興源食品有限公司;辛烯基琥珀酸酐(OSA) 深圳市思利凱貿易有限公司;阿魏酸(FA) 陜西森弗天然制品有限公司;Novozym435脂肪酶 丹麥諾維信Novozymes;葡萄籽油 遼寧佳時保健植物油開發有限公司;其他試劑 均為分析純。

ULTRA TURRAX? T25高速分散機 德國IKA公司;Nicolet 380型傅立葉紅外光譜儀 Termo公司;D-max-2500型X射線衍射儀 日本理學公司;DHG-9146A型電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;NHITACHIS-3400掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Olympus BX50光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司;TSC SP8激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司;Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀 英國馬爾文公司;UV-1200S型紫外可見分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥淀粉的制備 參考肖志剛等[14]的方法,將藜麥打磨成粉后過100目篩,取篩下物烘箱烘干備用。稱取一定量烘干后的藜麥粉,按照料液比(1∶5 g/mL)的比例加入0.2%的NaOH溶液,攪拌3 h后,靜置18 h。混合溶液離心(5000 r/min,10 min)后,留取中間層淀粉反復離心、洗滌后調節溶液pH為中性,將離心后的沉淀置于40 ℃烘箱中干燥48 h后粉碎,過100目篩密封保存。

1.2.2 OSA疏水改性藜麥淀粉酯制備 準確稱取一定量的藜麥淀粉,將其配制成30%淀粉溶液,置于35 ℃水浴鍋中,用3% NaOH溶液調節pH為8.0后,緩慢滴加OSA(淀粉干基質量的3%),控制在30 min內加完,繼續反應210 min。反應結束后,用0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH至6.5,將溶液離心(4000 r/min,10 min),取沉淀加入80%乙醇溶液洗滌2次(離心),蒸餾水洗滌2次(離心)。留取下層淀粉于40 ℃烘箱中干燥48 h,粉碎過100目篩密封保存。

1.2.3 阿魏酸藜麥淀粉酯制備 參考李泉薈[15]的方法并做適當修改。稱取5.0 g經OSA改性的淀粉藜麥淀粉置于50 mL磨口三角瓶中,分別加入7%的阿魏酸(占淀粉干基),加入10 mL異辛烷與1%、2%、3%、4%的脂肪酶(占淀粉干基),置于70 ℃水浴鍋中加熱反應5 h。反應后產物用無水乙醇反復洗滌(5000 r/min,離心10 min),干燥后的產物進行取代度檢測。

1.2.4 阿魏酸藜麥淀粉酯取代度測定 標準曲線的繪制:準確稱取一定量的阿魏酸標準品,配制成質量濃度分別為1、2、3、4、5、6 μg/mL的標準溶液,在320 nm處測定溶液吸光值,以溶液濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制曲線,得到阿魏酸的標準曲線。

淀粉酯的水解:稱取0.1 g干燥后的產物置于帶塞三角瓶中,加入30 mL 1 moL/L NaOH溶液,在50 ℃磁力攪拌下水解3 h。水解后用1 moL/L鹽酸滴定至pH2.0左右并記錄消耗體積,移取20 mL水解液于分液漏斗中,用100 mL乙酸乙酯萃取4次,備用。

取代度的測定:利用紫外可見分光光度計,在320 nm下測定萃取液吸光值,根據標準曲線計算得到阿魏酸含量,并按下述公式計算取代度:

式(1)

式(2)

式中:W為阿魏酸在淀粉酯中的質量百分比,C為根據標準曲線計算得出的阿魏酸濃度,V為萃取液體積,m0為阿魏酸藜麥淀粉酯的質量,M為阿魏酸分子量,194.19。

1.2.5 阿魏酸藜麥淀粉酯Pickering乳液的制備 乳液制備參考Laudina等的方法并略做修改[16],稱取一定量的阿魏酸藜麥淀粉酯(取代度分別為0.09%、0.28%、0.49%、0.69%,粒子濃度為1%)顆粒加入到去離子水中,去離子水與葡萄籽油的添加比例為6∶4 (V/V),高速分散機(13500 r/min)分散2 min。

1.2.6 傅里葉紅外光譜掃描(FT-IR) 準確稱取已干燥好的5.0 mg原藜麥淀粉與改性后的淀粉酯樣品,與溴化鉀粉末混合均勻,研磨10 min。對淀粉進行波長掃描(4000～400 cm-1),分辨率為4 cm-1,掃描累加64次。操作溫度為室溫,紅外圖譜用OMNIC8.0軟件進行處理[17]。

1.2.7 X-射線衍射(XRD) 采用D-max-2500型X射線衍射儀測試,準確取0.50 g原藜麥淀粉與改性后的淀粉酯樣品,壓片后采用Cu-Kα靶,石墨單色器40 kV和2000 mA,掃描速度為2 °/min在2θ在3 °～40 °范圍內掃描測得。采用MDI Jade6.0軟件對X射線衍射數據進行擬合處理,對原始圖進行平滑處理,連接衍射曲線上左右兩端的最低點做出基線,采用非線性高斯(Gaussian)和洛倫茲(Lorentz)混合函數對圖譜進行擬合計算。根據擬合曲線在衍射峰的下邊緣劃出一條平滑的曲線,位于基線和擬合曲線之間的面積為非衍射面積,衍射峰與平滑曲線之間的面積即為結晶峰衍射面積,相對結晶度采取下面公式計算[18]:

式(3)

式中:Ac和An分別代表結晶區域和無定型區域,Xc為結晶度。

1.2.8 Pickering乳液粒徑和Zeta電位的測量 參考鹿瑤等[19]的方法略作修改。移取0.10 mg/mL 樣品于密封容器中,上樣體積1 mL,測定過程中設折光系數為1.450,25 ℃下保溫平衡2 min。

1.2.9 Pickering乳液結構表征

1.2.9.1 Pickering乳液光學顯微鏡 取Pickering乳液樣品,滴加到潔凈載玻片中央,加蓋蓋玻片,置于Olympus BX50光學顯微鏡載物臺上,用100倍光學顯微鏡進行觀察,利用儀器自帶軟件獲得乳液顯微結構圖像。

1.2.9.2 Pickering乳液掃描電鏡(SEM) 參照Kalashnikova等[20]的方法稍加修改。配制顆粒濃度為1% w/v的懸浮液,選用苯乙烯作為油相,V65為油性引發劑,按120∶1 (w∶w)混合,用高速分散器將油相與懸浮液按1∶10 (w∶w)分散2 min,轉速為13500 r/min,每30 s間隔10 s,室溫下放置幾分鐘,取上層乳液層注入培養皿,加入蒸餾水稀釋,使之剛好沒過培養皿底部,置于65 ℃水浴鍋上過夜烘干,干燥后的樣品在掃描電鏡下觀察。

1.2.9.3 Pickering乳液激光共聚焦顯微鏡(CLSM) 取1 mL新鮮制備的乳液樣品加入20 μL尼羅紅(1 mg/mL)和40 μL尼羅藍(1 mg/mL)兩種熒光染料染色。移取20 μL樣品固定于激光共聚焦顯微鏡載物臺上,激發波長為488和633 nm,采集熒光圖像。

1.2.10 Pickering乳液乳化性的測定 參考劉瑞琦等[21]方法做微小改動。取新制乳液靜置0、10 min的底部樣品,用0.1% SDS稀釋200倍,以SDS做空白對照,在500 nm 波長處用紫外分光光度計測定吸光度,計算乳化活性指數(Emulsifying activity index,EAI)與乳液穩定性指數(Emulsion stability index,ESI)。EAI、ESI計算見公式4和公式5:

式(4)

式(5)

式中:T=2.303,N為稀釋倍數200,θ為油相體積分數0.4,L為比色杯的厚度1 cm,C為乳液中淀粉質量濃度(6 mg/mL),A0為0 min的吸光度,EAImin、EAImax為乳濁液放置 10、0 min后的 EAI值。

1.2.11 ABTS+法測定Pickering乳液抗氧化活性 ABTS+使用液由5 mL 7 mmol/L ABTS+溶液和5 mL 2.45 mmol/L K2S2O8溶液避光反應12 h后配制得到。使用前用適量蒸餾水稀釋,直至其吸光度在732 nm波長處為0.70±0.02。取0.4 mL不同阿魏酸取代度的阿魏酸藜麥淀粉酯乳液至3 mL ABTS+溶液中,避光反應30 min,于732 nm 測吸光度。清除率按以下公式計算[22]:

式(6)

其中:A0為無水乙醇與ABTS的吸光度;A為不同取代度樣品與ABTS的吸光度。

1.3 數據處理

實驗數據為3個樣品的平均值。結果采用SPSS 20.0和Origin 9.5軟件處理,采用ANOVA對數據進行差異顯著性分析(P<0.05)。所有樣品重復測定3次,結果為3次測量的平均值。

2 結果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜(FT-IR)

圖1為原藜麥淀粉、OSA改性藜麥淀粉與阿魏酸藜麥淀粉酯的紅外光譜圖。由圖1可知,未經改性的原藜麥淀粉(LMS)紅外光譜曲線在3000～3550 cm-1處出現一個寬而強的吸收峰,歸屬藜麥淀粉中-OH的伸縮振動峰,2931 cm-1處的特征吸收峰由-CH2的伸縮振動產生,1640 cm-1處的吸收峰由淀粉與水分子結合所形成的吸收峰,950～1065 cm-1處明顯的吸收峰是由藜麥淀粉C-O-C中C-O的振動而產生的[14]。經辛烯基琥珀酸酐改性的藜麥淀粉樣品(LMS-OSA)和原藜麥淀粉相比,在1570和1726 cm-1附近出現羧基(-COOH)和酯基(-C=O)的伸縮振動峰,淀粉分子中的羥基已被辛烯基琥珀酸酐中的羧基和酯基取代,證明了藜麥淀粉與辛烯基琥珀酸酐發生了酯化反應[23]。藜麥淀粉經阿魏酸二次酯化改性后,在波長2933 cm-1附近出現尖峰狀特征峰,歸因于阿魏酸中苯環上O-CH3的不對稱伸縮振動峰,且隨著阿魏酸取代度的增加,特征峰的強度增強,進一步證明阿魏酸接枝到辛烯基琥珀酸淀粉酯中。

圖1 阿魏酸藜麥淀粉酯傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of ferulic acid quinoa starch ester注:LMS為藜麥淀粉;LMS-OSA為OSA改性藜麥淀粉;LOF-0.09%、LOF-0.28%、LOF-0.49%、LOF-0.69%分別為阿魏酸的取代度為0.09%、0.28%,0.49%和0.69%的阿魏酸藜麥淀粉酯，圖2同。

2.2 X-射線衍射分析(XRD)

圖2為原藜麥淀粉和藜麥淀粉酯的X射線衍射圖。由圖2可知,原藜麥淀粉、OSA改性藜麥淀粉、不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯均在2θ為15.0°、17.0°、18.0°和23.0°處有強烈吸收峰,說明原藜麥淀粉、OSA改性藜麥淀粉、不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯均屬于典型A型結晶結構。原藜麥淀粉和OSA改性藜麥淀粉的結晶度分別為22.71%和11.75%。LOF-0.09%、LOF-0.28%、LOF-0.49%和LOF-0.69%的結晶度分別為11.07%、9.16%、8.95%和8.62%。改性后的藜麥淀粉酯結晶度降低,隨著阿魏酸取代度的增加,結晶度呈降低趨勢。可能是因為酯化反應使淀粉顆粒內部結晶區域被破壞,無定形區增加[24]。隨著取代度的增加,藜麥淀粉分子無序化程度增加,從而引起結晶度降低。

圖2 阿魏酸藜麥淀粉酯的X射線衍射圖Fig.2 XRD of ferulic acid quinoa starch ester

2.3 不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯對Pickering乳液粒徑和電位的影響

表1為不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的粒徑和電位變化。由OSA改性藜麥淀粉穩定的Pickering乳液液滴粒徑為65.35 nm,隨著阿魏酸淀粉酯取代度的增加,乳液液滴粒徑呈增大趨勢,當阿魏酸取代度為0.69%時,乳液粒徑達到695.27 nm。這可能是由于阿魏酸可以通過氫鍵、范德華力和疏水相互作用等作用力引起淀粉分子發生一定程度的聚集,促使淀粉粒徑增大,進而引起乳液液滴粒徑增大[25]。乳液液滴相互碰撞并結合成更大的液滴也可導致乳液粒徑的增大[26]。由表1可以看出隨著阿魏酸取代度的增加,電位絕對值降低。可能是淀粉顆粒所帶電荷對 Pickering 乳液的穩定性產生的影響。隨著取代度的增加,淀粉酯酸性增強,液滴表面所攜帶的正電荷增多,Zeta電位下降[27]。鹿瑤等[19]的研究結果表明,Zeta電位絕對值越高,乳化油滴之間的靜電排斥作用就越強,可以有效地阻止液滴的相互靠近和聚集,這與本實驗結果相一致。

表1 不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯對Pickering乳液的粒徑、Zeta電位和結晶度的影響Table 1 Effect of different ferulic acid substitution degrees on particle size,Zeta potential and crystallinity of Pickering emulsion

2.4 Pickering乳液微觀結構的表征

2.4.1 乳液光學顯微鏡的結果 圖3為不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的顯微圖片。由圖3可知,Pickering乳液的液滴呈規則的圓球狀。淀粉顆粒在水油界面處聚集,油滴和油滴周圍形成致密層[28]。隨著阿魏酸取代度的增加,乳液液滴尺寸大小呈上升趨勢,與高阿魏酸取代度的樣品相比,當阿魏酸取代度為0.09%時,淀粉層阻止了油滴間的聚集,乳液穩定性較好,經實驗室放置60 d未出現破乳油相上浮現象,隨著阿魏酸取代度的增加,乳液中出現肉眼可見較大液滴,表明低阿魏酸取代度的乳液穩定性較好,乳液分層現象不明顯。

圖3 阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的光學顯微鏡圖像Fig.3 Optical microscope image of Pickering emulsion stabilized with ferulic acid quinoa starch ester注:a. 未接枝阿魏酸的藜麥淀粉酯乳液;b. 阿魏酸取代度為0.09%的阿魏酸藜麥淀粉酯乳液;c. 阿魏酸取代度為0.28%的阿魏酸藜麥淀粉酯乳液;d. 阿魏酸取代度為0.49%的阿魏酸藜麥淀粉酯乳液;e. 阿魏酸取代度為0.69%的阿魏酸藜麥淀粉酯乳液;圖4～圖5同。

2.4.2 掃描電鏡(SEM)的結果分析 Pickering乳液的掃描電鏡照片見圖4。實驗選用苯乙烯替代油相,采用掃描電鏡表征了制備的乳液在干燥狀態下的微觀結構,可直觀地觀察到液滴的表面結構。由圖4可以看出,液滴內部苯乙烯揮發后,外部整體呈現圓球形,證明阿魏酸藜麥淀粉酯顆粒具有較好的穩定油相的能力,穩定后的液滴呈圓球形。隨著阿魏酸取代度的增加,淀粉顆粒失去原有平滑表面,產生褶皺,在乳液中表現為穩定性下降,液滴容易產生團聚[29]。阿魏酸淀粉酯顆粒吸附在油水界面,淀粉顆粒阻止了液滴之間的相互聚集,進一步證明阿魏酸藜麥淀粉酯顆粒可以用來穩定Pickering乳液。

圖4 阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的掃描電鏡圖像Fig.4 SEM of Pickering emulsion stabilized with ferulic acid quinoa starch ester

2.4.3 激光共聚焦(CLSM)的結果分析 圖5為阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的激光共聚焦圖像。在激發波長633 nm下,球形液滴周圍圓圈即阿魏酸藜麥淀粉酯呈現藍色,激發波長為488 nm時,紅色熒光即油滴位于球形液滴中。所有樣品均呈現出外部阿魏酸藜麥淀粉酯包裹內部油滴,表明乳液是由位于油-水界面的改性淀粉顆粒穩定的,改性淀粉酯吸附在油水界面并阻礙了油相的聚集[30]。從圖5a可以看出,未接枝阿魏酸的乳液液滴小而均勻分布在乳液中,證明OSA改性藜麥淀粉顆粒可以穩定Pickering乳液,乳液穩定性優良。隨著阿魏酸取代度的增加,油滴尺寸明顯增大,這可能由于阿魏酸取代度的增加,阿魏酸與OSA基團發生競爭,阿魏酸藜麥淀粉酯上所保留的OSA基團減少,親水基團酚羥基增多,乳液親水性增強,乳液液滴易于水相融合,導致穩定性下降,從而使乳液液滴間產生相互聚集。也可能是因為乳液液滴之間的相互碰撞擠壓,界面淀粉酯層結構受損使得部分液滴發生聚合,內相體積增大,在CLSM圖中表現為紅色油滴尺寸變大[31]。

圖5 阿魏酸藜麥淀粉酯穩定Pickering乳液的CLSM圖像Fig.5 CLSM of Pickering emulsion stabilized with ferulic acid quinoa starch ester

2.5 Pickering乳液的乳化性

圖6為不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯對Pickering乳液乳化性能的影響。EAI表示在乳液中固體顆粒能夠強烈吸附在油水兩相界面形成乳化層的能力,ESI表示乳液中乳滴的穩定能力,分別是表征乳液乳化特性和乳液體系穩定性的重要指標[32]。由圖6可以看出,隨著阿魏酸取代度的增加,乳液的乳化活性與乳液穩定性整體呈下降趨勢,乳液層隨取代度的增加分層現象愈加明顯,乳液層中出現明顯圓形大液滴,表明淀粉顆粒包裹油滴能力隨取代度的增加而減弱。在乳化體系中EAI和ESI與界面張力有關,界面張力越高乳化劑的乳化性能越低[33]。隨著阿魏酸取代度的增加,阿魏酸與OSA基團發生競爭,阿魏酸藜麥淀粉酯中疏水烯基長鏈減少,親水性的酚羥基基團增加,導致淀粉酯疏水性降低,在溶液中表現為乳液液滴空間位阻減弱,界面張力增大,淀粉顆粒無法完全包裹油滴,液滴之間相互聚集形成較大液滴,進而導致乳液失穩。

圖6 不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯對乳化活性和乳液穩定性影響Fig.6 Effect of Pickering emulsion with different substitution degree of ferulic acid quinoa starch ester on emulsifying activity and emulsion stability

2.6 Pickering乳液對ABTS+自由基清除能力

圖7為不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯Pickering乳液對ABTS+自由基清除能力影響。由圖7可知,4種接枝阿魏酸的乳液樣品均有良好的抗氧化效果,對ABTS+自由基清除效果與阿魏酸淀粉酯的取代度呈正相關性[34]。說明了阿魏酸淀粉酯在乳液界面的抗氧化機理,即雙酯化法改性后的淀粉酯中抗氧化基團酚羥基隨著阿魏酸取代度的增加而增加。Mathew等[29]研究發現,高阿魏酸取代度的淀粉酯具有較高的自由基清除能力,實驗結果與本研究結果一致。未接枝阿魏酸時,ABTS+自由基清除率為5.37%,當阿魏酸取代度為0.69%時,ABTS+自由基清除率為70.77%,用阿魏酸藜麥淀粉酯來穩定Pickering乳液可有效改善其抗氧化性。

圖7 不同取代度阿魏酸藜麥淀粉酯Pickering乳液對ABTS+自由基清除能力影響Fig.7 Effect of Pickering emulsion with different substitution degree of ferulic acid quinoa starch ester on ABTS+ free radical clearance rates

3 結論

實驗以阿魏酸藜麥淀粉酯為原料構建Pickering乳液,考察了不同阿魏酸取代度對Pickering乳液基本結構和抗氧化性的影響規律。實驗結果表明,經辛烯基琥珀酸酐和阿魏酸雙酯化改性后會導致藜麥淀粉酯結晶度降低,微觀結構分析表明,Pickering乳液液滴呈圓球形,隨著阿魏酸藜麥淀粉酯取代度的升高,乳液液滴粒徑增加,電位下降,乳液穩定性下降。辛烯基琥珀酸藜麥淀粉酯經阿魏酸二次酯化作用,具有抗氧化特性的酚羥基成功接枝到淀粉酯上。當阿魏酸取代度為0.09%時,乳液ABTS+自由基清除能力由5.37%提高到10.82%,對構建抗氧化型Pickering乳液基食品體系奠定了理論基礎。本實驗選用阿魏酸具有一定的抗氧化效果,但是其疏水特性有待改善,后續研究可繼續探索更合適的兼具疏水特性和抗氧化特性的食品級原料,構建抗氧化性高和穩定性優良的食品級 Pickering乳液。