組合酶對復合骨素酶解液呈味物質的影響

李曉瑞,王 梓,劉貴珊,*,趙君哲,余江泳,張曉娟,樊奈昀(.寧夏大學農學院,寧夏銀川 7500;.撫順獨鳳軒骨神生物技術股份有限公司,遼寧撫順 3)

骨素是骨經過高溫高壓抽提、脫除油脂和濃縮得到的骨抽提物,其營養豐富,富含蛋白質、氨基酸、礦物質以及風味物質等,是生產調味品的重要基料[1]。牛骨素香精雖口感醇厚、肉味飽滿,但是鮮味不足,生產過程中需要添加呈味核苷酸二鈉來增強牛骨素香精的鮮味,增加生產成本。雞骨素鮮味濃郁,且雞骨原料相較于牛骨原料成本略低,通過兩種骨素復合可以降低生產成本、達到改善牛骨素香精的鮮味、減少添加呈味核苷酸二鈉的目的。目前,對牛骨素、雞骨素、豬骨素的滋氣味和加工性能的研究報道較多,但是對復合骨素報道較少[2-6]。

生物酶解技術是生產天然安全調味基料的常用方法,其反應條件溫和、能耗低、污染少,反應進程定向、可控,在骨素風味形成中起到非常重要的調節作用[7]。用于酶解骨素蛋白的蛋白酶主要包括內切蛋白酶和外切蛋白酶。內切蛋白酶能識別特有的氨基酸序列,將連接氨基酸的酰胺鍵從酶切位點斷開,得到長短不同的多肽和氨基酸[8]。外切蛋白酶作用于蛋白質或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵,釋放末端的疏水性氨基酸,但是對于蛋白質內部肽鍵幾乎沒有作用,因此將外切酶與內切酶組合使用可以深度水解蛋白質,提高酶解液水解度,釋放大量氨基酸和短肽[9]。目前,國內外研究主要集中于雞骨素、牛骨素、豬骨素酶解種類的選擇,對復合骨素酶種類的選擇少有研究。喬凱娜等[10]通過研究紅燒風味香精滋味物質,發現木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和菠蘿蛋白酶組合酶解豬肉,得到的紅燒風味香精感官評分更高。董憲兵等[11]通過組合酶酶解雞骨素工藝及風味物質研究表明,木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的添加方式對雞骨素風味物質有重要影響。徐欣如等[12]探究了單酶和組合酶對牛骨素熱反應香精滋氣味的影響,發現復合蛋白酶和風味蛋白酶組合酶解牛骨素效果最佳。Chiang等[13]通過探究美拉德反應對牛骨酶解液理化性質及風味成分的影響,發現風味蛋白酶酶解牛骨素可以改善牛骨酶解液風味。

本文以牛骨素和雞骨素的復合骨素為研究對象,采用四種組合蛋白酶(木瓜蛋白酶+風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶+風味蛋白酶、堿性蛋白酶+風味蛋白酶、復合蛋白酶+風味蛋白酶)酶解復合骨素,通過測定水解度、游離氨基酸、呈味核苷酸、味精當量、肽分子量分布等呈味物質指標,探究組合酶種類對四種復合骨素酶解液呈味物質的影響,為復合骨素酶解深加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清湯型牛骨素、雞骨素 撫順獨鳳軒骨神生物技術股份有限公司;復合蛋白酶(Protamex,47500 U/g)、風味蛋白酶(Flavourzyme,25000 U/g)、木瓜蛋白酶(Nematolyt,157000 U/g)、堿性蛋白酶(Alkaline proteinase,302420 U/g)、菠蘿蛋白酶(Bromelain,600000 U/g) 丹麥諾維信公司;葡萄糖 源葉生物科技有限公司;甲醛、氫氧化鈉、磺基水楊酸、鹽酸、磷酸二氫鉀、三氟乙酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,飛賽爾科技(中國)有限公司;混合氨基酸標準品、核苷酸標準品(5′-GMP、5′-IMP和5′-AMP)、肽標準品(甘氨酸、抑肽酶、細胞色素C、桿菌肽、谷胱甘肽) 美國Sigma公司。

BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋、JI-1 精密增力電動攪拌器 國華電器有限公司;TSK-gel ODS-80 TM色譜柱(4.6 mm×250 mm) 美國J&W公司;TSK gel G2000 SWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm) 日本島津公司;1260高效液相色譜儀、AgilentEclipse XDB-C18柱 美國Agilent公司;8900全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合骨素酶解液的制備 取牛骨素(Brix=50%)70 g,雞骨素(Brix=50%)30 g,按1∶1添加蒸餾水稀釋,四種組合酶在pH為6.2的條件下,按表1條件酶解1 h后,90 ℃滅酶10 min,制得四種復合骨素酶解液,其中E/S為每克蛋白中酶活的添加量。

表1 復合骨素提取物酶解條件Table 1 Conditions for enzymatic hydrolysis of complex bone extract

1.2.2 水解度測定 氨基酸態氮采用甲醛滴定法進行測定[14]。準確吸取5 mL酶解液至100 mL容量瓶,并添加蒸餾水定容,從中取20 mL稀釋液至燒杯中,加入60 mL蒸餾水混勻,在磁力攪拌狀態下,用標定好的0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH8.2,加入10 mL甲醛溶液后繼續滴定至pH9.2,記錄消耗的NaOH溶液體積。80 mL蒸餾水在相同條件下進行滴定,作為空白溶液。溶液中氨基酸態氮含量的計算公式為:

式中:x為溶液中氨基酸態氮的含量(g/100 g);V1為滴定樣品時，pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V2為滴定空白溶液時,pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V3為參與反應的稀釋液體積(mL);C為NaOH溶液濃度(C=0.05 mol/L)。

總蛋白質含量通過FOSS全自動凱氏定氮儀進行測定,消化程序為200 ℃消化30 min,升溫至420 ℃消化1 h。水解度的計算公式為:

1.2.3 游離氨基酸含量的測定 參照Chungchunlam等[15]的方法,并稍作修改。取復合骨素酶解液2 mL、2 mL 40% 磺基水楊酸于10 mL離心管內,然后在10000 r/min下、4 ℃離心20 min,取上清液于50 mL離心管中,并用超純水定容,過0.22 μm濾膜,待氨基酸分析儀上機。

氨基酸分析條件[16]:色譜柱為日立專用離子交換樹脂(4.6 mm×60 mm),檢測波長為440 nm;緩沖液流速35 mL/h;柱溫 31～76 ℃;茚三酮溶液流速25 mL/h;進樣量20 μL。

1.2.4 核苷酸含量的測定 參照Chen等[17]的方法,并稍作修改。取復合骨素酶解液1 mL于50 mL離心管內,加25 mL超純水,然后在10000 r/min下、4 ℃離心20 min,取上清液于50 mL離心管中,并用超純水定容,過0.22 μm濾膜,待HPLC測定。

高效液相色譜條件[18]:色譜柱為TSK-gel ODS-80 TM(4.6 mm×250 mm),柱溫為30 ℃,紫外檢測波長為254 nm,進樣量為10 μL,流速為0.8 mL/min。流動相:洗脫液A為甲醇,洗脫液B為pH為5.4的0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液;流動相經0.45 μm濾膜過濾后,在室溫下超聲脫氣30 min。采用二元流動相進行梯度洗脫分離,檢測時間為23 min,其中甲醇0.05 mol/L磷酸二氫鉀隨時間配比為:0 min:0～100%;11 min:10%～90%;18 min:0～100%;23 min:0～100%。

1.2.5 味精當量分析 鮮味氨基酸與核苷酸協同作用所產生的鮮味強度相當于一定濃度的單一味精所產生的鮮味強度[19],即為味精當量EUC(10-2g MSG/mL),計算式如下:

EUC=Σai×bi+1218(Σai×bi)(Σaj×bj)

式中:ai為鮮味氨基酸(Asp,Glu)的含量,g/100 mL;bi為鮮味氨基酸相對于谷氨酸鈉(MSG)的相對鮮度系數,其中,Asp 的b值為0.077,Glu 的b值為1;aj為呈味核苷酸(5-IMP、5-GMP、5-AMP)的含量,g/100 mL;bj為呈味核苷酸相對于5-IMP 的相對鮮度系數,其中,5-IMP 的b值為1,5-GMP的b值為2.3,5-AMP的b值為0.18。

1.2.6 肽分子質量分布的測定 參照Chiang等[20]的方法,并稍作修改,采用高效液相色譜儀測定復合骨素酶解液分子量分布。色譜柱為TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm×300 mm);柱溫:40 ℃;流動相:A為體積分數為0.1%的三氟乙酸混合的45%(V/V)乙腈溶液;等梯度洗脫;流速:0.5 mL/min;進樣體積:10 μL,于214 nm波長下測定響應值。

1.3 數據處理

曲線圖的繪制采用origin 2017軟件,顯著性分析及相關性分析采用SPSS 19.0軟件進行處理,每個實驗在相同條件下重復三次。

2 結果與分析

2.1 水解度分析

酶的種類及水解度對復合骨素酶解液的風味有重要影響。圖1為四種組合酶對復合骨素酶解液水解度的影響,A+F與P+F酶解液的水解度最大,分別為10.67%和11.27%(P>0.05)。復合蛋白酶是由內切蛋白酶、外切肽酶以及風味蛋白酶復合而成的,具有較多的切割位點,因此復合蛋白酶與外切風味蛋白酶組合酶解后水解度大[21]。堿性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶,能夠切割芳香族或疏水性氨基酸殘基的肽鍵,再與風味蛋白酶組合,其水解度也會相對較大[22]。N+F與B+F酶解液的水解度最小,分別為8.60%和8.40%,木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶,也稱為巰基蛋白酶,可作用于肽鏈中精氨酸和賴氨酸的羧基端,并對N-端具有二個羧基的氨基酸具有優先水解性[23]。

圖1 蛋白酶對復合骨素酶解液水解度的影響Fig.1 Effect of protease on the degree of hydrolysis of compound osteolysin hydrolysate注:不同小寫字母代表化合物在4種酶解液間的顯著性差異(P<0.05);圖2、表2～表5同。

2.2 游離氨基酸分析

蛋白酶的酶切位點決定了酶解產物中游離氨基酸的組成及含量,使酶解產物中游離氨基酸組成有較大的差異,同時,游離氨基酸的組成及含量對酶解液滋味有著重要影響[24]。如表2所示,不同復合骨素酶解液中游離氨基酸含量存在較大差異,A+F酶解液的總氨基酸含量最高,P+F酶解液次之,這可能由于堿性蛋白酶主要裂解疏水性氨基酸,與風味蛋白酶組合酶解后,制得的酶解液中含有大量的疏水性氨基酸[25]。復合蛋白酶是由多種蛋白酶復合而成,與風味蛋白酶組合酶解后,可從肽鏈的任意一端切下一個單位氨基酸殘基,也可在多肽鏈的內部破壞肽鍵,進而提高蛋白水解度,并產生大量的游離氨基酸[26]。而N+F與B+F的水解度低,木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶的酶切位點主要為羧基端,易于釋放苦味氨基酸,且酶切位點特異性強,所以N+F與B+F酶解液總游離氨基酸含量低。

表2 蛋白酶對復合骨素酶解液游離氨基酸的影響Table 2 Effect of protease on free amino acids in compound osteolysin hydrolysate

不同復合骨素酶解液中共檢測到17種游離氨基酸。氨基酸根據其結構特性不同,可分為呈鮮味、甜味、苦味、無味氨基酸,呈味氨基酸含量高可以增加酶解液的鮮味、濃厚感和豐富度[27]。鮮味氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸,這兩種氨基酸在A+F、P+F和N+F酶解液中含量較高,其中谷氨酸本身具有酸味,但和鈉鹽并存時,可以提供強烈的鮮味,是重要的鮮味氨基酸[28]。甜味氨基酸中的甘氨酸和丙氨酸在復合骨素酶解液中檢出量較高,甘氨酸除了增強甜味,還可以改善酶解液的苦味[29]。同時,谷氨酸和丙氨酸共存時產生協同作用,可增強酶解液的鮮味[30]。A+F、P+F和B+F酶解液中苦味氨基酸含量最高,同時A+F與P+F酶解液中苯丙氨酸和亮氨酸含量較N+F與B+F酶解液更高。無味氨基酸包括酪氨酸、半胱氨酸和賴氨酸,半胱氨酸可以增強酶解液的肉香味,其中P+F酶解液中半胱氨酸含量最高,肉香味更強[31]。總的來說,酶解液中的游離氨基酸能賦予食物特定的味感,為Maillard反應制備熱反應型肉味香精提供豐富底物。

2.3 呈味核苷酸分析

AMP、GMP、IMP是主要的低閾值呈鮮味物質,AMP由 ATP 降解產物生成還可以降解為IMP,GMP 是植物性食品如菌類食品中主要呈鮮物質,IMP 主要存在于動物性食品。AMP、GMP、IMP是肉類食品中主要的風味核苷酸,有助于提升肉質的鮮味[32]。本研究測定了四種復合骨素酶解液中3種核苷酸含量,如表3所示,四種酶解液中IMP含量最高,這可能由于復合骨素屬于肉類食品,自身就含有大量的IMP,酶解后得到大量釋放,以及AMP在酶解過程中發生降解反應,導致IMP含量相對于AMP和GMP較高[33-34]。同時,IMP與AMP有協同作用,且與天冬氨酸、谷氨酸等鮮味氨基酸共存時能增強復合骨素酶解液的鮮味和甜味[35]。四種酶解液中,A+F酶解液所含核苷酸含量最高,P+F酶解液次之,N+F酶解液核苷酸含量最低,有研究表明酶解液中水解度高低對核苷酸含量有影響[36],A+F與P+F酶解液的水解度較大,所以其核苷酸含量也相對較高。

表3 蛋白酶對復合骨素酶解液呈味核苷酸的影響Table 3 Effect of protease on taste-flavored nucleotides of compound osteolysin hydrolysate

2.4 味精當量分析

EUC表示鮮味氨基酸與呈味核苷酸的混合物協同作用所產生的鮮味強度,被用來衡量氨基酸與核苷酸的協同效應,是國際上通行的研究食品鮮味的分析方法[37]。如圖2所示,A+F酶解液的EUC值最高為4.26×10-2g MSG/mL,其次是P+F酶解液的EUC為3.83×10-2g MSG/mL,B+F酶解液的EUC最低為2.73×10-2g MSG/mL,EUC表示鮮味氨基酸及呈味核苷酸之間的協同效應,其值的大小由鮮味氨基酸及呈味核苷酸含量共同決定。復合蛋白酶其酶切位點廣泛,堿性蛋白酶主要裂解疏水性氨基酸,兩種酶分別與外切酶風味蛋白酶組合酶解復合骨素,可增強酶解液水解度,產生大量游離氨基酸。因此,A+F與P+F酶解液的水解度大,其鮮味氨基酸和核苷酸含量也相對較高,有較為強烈的鮮味強度。同時,有研究表明甜味氨基酸與IMP協同作用可以增強鮮味[38],而A+F與P+F酶解液的甜味氨基酸含量與IMP核苷酸含量較N+F和B+F酶解液更高。

圖2 蛋白酶對復合骨素酶解液EUC的影響Fig.2 Effect of protease on EUC of compound osteolysin hydrolysate

2.5 肽分子量分布分析

多肽分子量分布是Maillard反應的重要表征指標之一。劉建彬[39]發現分子量<1000 Da的肽段更具有美拉德反應活性,Toelstede等[40]發現分子量200～1000 Da的寡肽有獨特的增味作用。如表4所示,對比四種酶解液肽分子量分布發現,總體肽分子量分布差異不大,肽段分子量分布主要集中于分子量1000～3000、200～500和<200 Da,這可能由于分子量1000～3000 Da肽段發生肽聚集和肽交聯作用,使得該肽段分子量分布較多,而酶解使得蛋白和大分子肽段降解為分子量<500 Da的小分子肽段,為之后的美拉德反應提供豐富的物質基礎[41]。酶解液中小分子量肽所占比例越大,代表其水解程度越高,酶解效果越好。其中P+F和A+F酶解液中分子量<1000 Da肽段含量較高,說明P+F和A+F組合酶的水解度大、酶解效果好,這與2.1水解度分析中的結果一致。分子量<1000 Da肽段主要包括小肽、寡肽、小分子活性肽和游離氨基酸。復合骨素酶解過程中產生的肽類物質對酶解液風味的影響,主要是包括寡肽、游離氨基酸和其他呈味物質發生協同作用,使酶解液風味飽滿、口感協調。分子量<1000 Da肽段含量高的酶解液,其呈味肽的含量也可能相應較高[42-43]。根據水解度和分子量<1000 Da肽段含量的差異,說明P+F和A+F組合酶制備復合骨素酶解液的呈味效果明顯優于N+F和B+F組合酶。

表4 蛋白酶對復合骨素酶解液肽分子量分布的影響Table 4 Effect of protease on molecular weight distribution of compound osteolysin hydrolysate

2.6 主成分分析

為了進一步明確酶種類對復合骨素酶解液呈味物質的影響,利用SPSS 19.0對四種酶解液的水解度、鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、無味氨基酸、IMP、GMP、AMP、EUC、分子量<1000 Da的肽段進行主成分分析(Principle component analysis,PCA)。將10維度的呈味物質指標數據進行標準化處理并分析各指標變量間的相關性,得到各指標間的相關矩陣。如表5所示,經PCA特征提取的前2個主成分,其特征值均大于1,累計方差貢獻率達到96.633%,基本涵蓋反映了所有變量的初始信息,因此,選取前2個主成分作為數據分析的有效成分。

表5 主成分的特征值和貢獻率Table 5 Eigenvalue and contribution rate of principal components

由10個指標的荷載系數與特征值計算得到10個因子的特征向量(見表6)。以特征向量為系數構建2個主成分的線性方程,如下所示:

主成分1的特征方程為:

Y1=0.320X1+0.287X2+0.252X3+0.341X4+0.331X5+0.331X6+0.327X7+0.315X8+0.325X9+0.322X10

主成分2的特征方程為:

Y2=-0.307X1-0.442X2+0.548X3-0.164X4+0.018X5-0.143X6+0.27X7+0.322X8+0.295X9-0.316X10

上述式中:Xi為標準化后的數據,i=0,1,2,…,10。

表6 主成分的載荷矩陣和特征向量Table 6 Principal loading matrix and component eigenvectors

表7 四種復合骨素酶解液呈味物質綜合得分Table 7 Comprehensive scores of four kinds of compound bone enzymatic hydrolysates

N+F與B+F酶解液綜合得分為負值,且B+F酶解液綜合得分值最小。A+F與P+F酶解液綜合得分為正值,A+F酶解液綜合得分值最大,說明使用A+F組合酶酶解復合骨素呈味物質含量更高,為后續美拉德反應提供更多反應物質。

3 結論

本研究以復合骨素為原料,采用四種組合酶酶解復合骨素,探究酶種類對復合骨素呈味物質的影響。結果表明,A+F和P+F酶解液的水解度最大分別為10.67%和11.27%;對呈味游離氨基酸組成分析發現,A+F和P+F酶解液的總游離氨基酸含量最高,P+F酶解液中半胱氨酸含量最高,肉香味更強;A+F酶解液的總核苷酸含量和EUC值最大;A+F和P+F酶解液分子量<1000 Da肽段含量最高,制備復合骨素酶解液的呈味效果更好;利用PCA綜合分析10個檢測指標,得到A+F組合酶的綜合得分最高,表明A+F酶解液為后續復合骨素酶解液美拉德反應提供更多的反應前體物質,更適合酶解復合骨素。復合骨素酶解液含有豐富的游離氨基酸和小分子活性肽,未來的研究可進一步開展復合骨素酶解液中的小分子肽種類的分離鑒定,研究美拉德反應條件、添加物種類對復合骨素酶解液呈味特性、功能特性和生理活性的影響,為復合骨素深加工利用提供理論參考。