堿性蛋白酶和谷氨酰胺轉氨酶對無麩質谷物饅頭發酵過程中風味特性的影響

李東紅,賈先勇,楊晉杰,杜佳陽,吳昊桐,朱力杰,周大宇,楊立娜,馬 濤,*(.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 03;.西藏軍區保障部采購服務站,西藏拉薩 850000)

乳糜瀉(celiac disease,CD)是一種因攝入麩質而誘發的小腸腸炎慢性疾病,是世界范圍內常見的食物過敏反應之一,有效的治療方法是堅持嚴格的無麩質飲食[1]。由此,無麩質谷物饅頭應運而生。由于原料中不含麩質(面筋),發酵和蒸制過程中存在二氧化碳保留困難,成型差,口感不佳等問題,因此,解決上述問題成為突破無麩質谷物饅頭生產瓶頸的技術關鍵[2],制作軟糯和品質優良的無麩質谷物饅頭成為一項重大挑戰。

研究結果表明,酶制劑可以對無麩質谷物饅頭進行品質等方面的改良。谷氨酰胺轉氨酶是一種共價交聯酶,它在不改變蛋白質功能特性的情況下,可提高蛋白質的營養價值,在無麩質產品開發中得到廣泛應用[3-4]。堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶可作用于谷類蛋白質的肽鍵,水解后可提高面團的品質[5-7]。翟舒[3]等研究發現TG酶與堿性蛋白酶可有效提高面團拉伸力,改善面團的流變學特性。

本研究前期優化了無麩質谷物饅頭加工工藝,確定了其生產工藝及配料的添加順序,采用二次發酵方式制作無麩質谷物饅頭,一次發酵前加入堿性蛋白酶酶解,二次發酵前加入TG酶進行交聯,此時饅頭的品質特性較為優良。添加酶制劑達到品質改良的目的,但是饅頭的風味特性是考究其整體品質的重要指標。孫祥祥等[8]應用固相微萃取-氣質聯用的方法,分析了不同米酒添加量制作的酵子對于酵子饅頭揮發性物質的影響,結果表明,米酒添加量的不同對于酵子饅頭風味物質的影響不同。閆博文等[9]應用電子舌分析不同乳酸菌發酵制備的饅頭滋味的差別,結果顯示γ-谷氨酰二肽與饅頭的咸味有直接的聯系。因此,本研究用電子舌分析添加酶制劑前后滋味的變化,運用電子鼻和GC-MS對無麩質谷物饅頭發酵前后氣味變化進行研究,進而分析成品饅頭的風味來源,為進一步研究和開發高質量無麩質食品提供理論依據[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生黃豆粉(26.2%蛋白質,6.0%脂肪,41.2%碳水化合物,11.0%含水量)和大米粉(7.7%蛋白質,10.0%脂肪含量,71.4%碳水化合物,11.3%含水量) 山東美樂嘉食品有限公司提供;堿性蛋白酶(酶活10萬U/g) 河南萬邦實業有限公司提供;植物乳桿菌 善恩康生物科技(蘇州)有限公司提供;TG酶(酶活10萬U/g) 東圣生物科技有限公司提供;氯化鉀、酒石酸 均為國產分析純試劑。

PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PE-3電子鼻 日本Insent公司;SA402B電子舌 日本Insent 公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司;7890-/5975 GC-MS儀 美國Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、20 mL頂空鉗口樣品瓶、固相微萃取裝置 美國Supelco公司;SPX-150B-Z生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;MZ-SYS28-2B 中式電蒸鍋廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無麩質谷物饅頭的制作 結合試驗探索,運用二次發酵法制備無麩質谷物饅頭,具體工藝如下所述:

對照組面團和饅頭的制作:稱取40 g大米粉和60 g大豆粉混勻,加入0.6 g酵母,1.3 g小蘇打,加入60 g水攪拌至面團光滑完整,發酵箱40 ℃發酵60 min,隨后50 ℃發酵90 min,取一定量對照組面團備用,將剩余面團分割為(50±1) g的小面團,成型后醒發20 min,于蒸鍋蒸制25 min,每次蒸制鍋內保持水位一致。將蒸制好的饅頭室溫下冷卻30 min備用。

不同發酵階段面團和饅頭的制作:稱取40 g大米粉和60 g大豆粉混勻,加入0.6 g酵母,1.3 g小蘇打,加入2 g堿性蛋白酶,55 g水添加后攪拌至面團光滑完整,40 ℃發酵60 min后取少量面團備用,備用面團的一部分醒發20 min后,分割成(50±1) g的面團置于蒸鍋上蒸制25 min,將蒸制好的饅頭室溫下冷卻30 min備用。將一次發酵剩余的面團繼續二次發酵,1.9 g堿性蛋白酶和1.5 g植物乳桿菌溶于5 g水后加入一次發酵后的面團,揉混面團至光滑,50 ℃發酵90 min后,取二次發酵結束后的面團備用,備用的部分面團分割成(50±1) g小面團,醒發20 min后于蒸鍋中蒸制25 min,室溫下冷卻30 min備用,不同試驗指標對面團和饅頭質量的需求不同,制作過程原料和配料可按比例變化。

1.2.2 電子舌分析 根據Cui等[11]方法進行電子舌測定,稱取對照組的面團和饅頭,一次發酵后的面團和饅頭,二次發酵后的面團和饅頭各50.0 g,真空冷凍干燥后粉碎分別加入150 mL去離子水,高速勻漿1 min后,置于離心機中3000×g離心20 min,取上清液100 mL備用。

SA402B電子舌儀器,含有5個測試傳感器和2個參比傳感器。其中重要的5個測試傳感器為CT0、CA0、C00、AAE和AE1,分別代表咸、酸、苦、鮮和澀味。測試傳感器的探頭置于參比溶液中浸泡24 h,進行活化;參比傳感器探頭置于KCl溶液浸泡24 h進行活化。將樣品上清液置于樣品杯測定,每個樣品測試6次,取3次穩定數據進行分析[12]。為了減小測量誤差,其余的樣品槽來放置正負電極液和基準液。

1.2.3 電子鼻分析 用PE-3電子鼻測定:參照李偉麗等[13]的方法,分別取5 g對照組的面團和饅頭、一次發酵后的面團和饅頭、二次發酵后的面團和饅頭于頂空瓶中,用三層保鮮膜密封,50 ℃水浴30 min,電子鼻進行氣味測定。電子鼻清洗時間為100 s,樣品準備時間為5 s,檢測時間為120 s,進行3次重復實驗。應用Winn Muster軟件分析面團及饅頭的風味變化。反應每個傳感器的性能參數參照劉楠等[14]的研究,如表1所示。

表1 傳感器性能描述Table 1 Sensor performance description

1.2.4 SPME-GC-MS檢測 固相微萃取操作方法:分別取對照組的面團和饅頭,一次發酵后的面團和饅頭,二次發酵后的面團和饅頭各5.0 g置于20 mL氣相頂空瓶,瓶蓋密封。將頂空瓶置于60 ℃恒溫磁力攪拌器中加熱50 min,將纖維萃取頭置于儀器進樣口活化60 min。活化后的萃取纖維頭于頂空瓶內萃取60 min,于進樣口250 ℃下解析5 min[15]。

氣相色譜和質譜分析操作方法:色譜條件采用HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為高純氦氣,流速為1.2 mL·min-1,不分流進樣;進樣口溫度為250 ℃;升溫程序:初始溫度為30 ℃,保持5 min,以 5 ℃/min的速率上升至250 ℃,保持15 min。

質譜條件離子源為EI源,電子能量為70 eV,界面溫度為280 ℃,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,質量掃描范圍為30～550 amu。

利用計算機對NIST 11譜庫、Wiley 7.0數據庫和保留時間(RTS)質譜庫進行計算機匹配,對不同發酵階段的面團和饅頭,用氣相色譜-質譜分析揮發性化合物進行了鑒定。保留匹配度大于70的物質,分析發酵過程中酶對于揮發性化合物的影響[16]。

1.3 數據處理

試驗均進行3次重復,應用Origin 8.5 軟件完成繪制圖表。線性判別應用PE-3電子鼻自帶Winn Muster軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 電子舌分析

滋味作為風味的重要組成部分,可以反映出食品的口感與味道。電子舌是一種可以對樣品進行模式識別和定性定量分析的檢測技術,其機制是通過電子傳感器探測味覺特征,從而模仿人類的味覺,可快速檢驗出產品的整體滋味,并對其分類,因此被廣泛應用于食品檢測行業[17]。無麩質谷物饅頭和面團在不同發酵階段特征信號響應值如圖1所示,電子舌的臨界值為-13,因此樣品的酸度值無法客觀反應[18]。其中,面團在發酵過程中,苦味、澀味和苦味的回味減弱,鮮味增強,而咸味、豐富度和澀味的回味無明顯變化。面團經蒸制成饅頭后,苦味和澀味、苦味的回味減弱,咸味和鮮味增強,而澀味的回味和豐富度無明顯變化。由于蛋白質在發酵過程中被內源性谷物蛋白酶和堿性蛋白酶酶解,產生的小分子肽和游離氨基酸,其是發酵制品產生獨特滋味的重要來源[19]。綜合對比后,經二次發酵的咸味和鮮味增強,苦味、澀味和苦味的回味減弱,澀味的回味和豐富度無明顯變化,可能與發酵過程中代謝形成的咸味氨基酸、鮮味氨基酸或小分子肽有關。經TG酶二次發酵后,蛋白質發生交聯,在酶的作用下合成具有不同滋味的小分子肽,鮮味變化較小,苦味和苦味的回味明顯減弱[20]。

圖1 無麩質谷物饅頭電子舌傳感器響應雷達圖Fig.1 E-tongue sensor response radar diagram of gluten-free grain steamed buns

為了進一步分析樣品之間的差異,利用PCA圖反應屬性和樣本之間的整體關系。從圖2中可以看出,第一主成分分析貢獻率為80.00%,第二主成分分析貢獻率為13.60%,兩種主成分的累計方差貢獻率93.60%,說明兩種主成分分析能夠代表樣品的整體信息。此外,不同發酵的樣品分布在不同的區域,說明其滋味發生明顯變化,可以較好地區分開。由此可以看出,堿性蛋白酶和TG酶的添加使饅頭在發酵過程中的滋味產生差異,且效果顯著。

圖2 無麩質谷物饅頭電子鼻的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of e-nose of gluten-free grain steamed buns

2.2 電子鼻分析

電子鼻系統對于樣品的揮發性風味物質很靈敏,不同物質輕微的變化即可通過傳感器響應值反應,因此可以獲得樣品中揮發性物質的完整信息[21]。無麩質谷物饅頭在發酵過程中的電子鼻雷達圖如圖3所示。

圖3 無麩質谷物饅頭香氣成分響應值電子鼻雷達圖(B為A放大圖)Fig.3 E-nose radar diagram of response value of aroma components of gluten-free grain steamed buns(B was the enlarged version of A)

圖3中的響應值表示傳感器的相對電阻率(G/G0)變化趨勢[22],由圖3 可以看出,不同發酵階段的面團和饅頭香氣外形輪廓不同,說明饅頭在發酵過程中揮發性物質存在差異,即不同酶的添加對于無麩質谷物饅頭揮發性物質變化有顯著影響。由圖3A可知,R2傳感器的響應值變化較明顯,且峰值依次為一次發酵面團>未發酵面團>二次發酵面團,二次發酵饅頭>一次發酵饅頭>未發酵饅頭。圖3B中,傳感器R5、R6、R8峰值變化較為分散,原因可能是不同發酵階段的面團和饅頭所含香氣不同。

為了進一步區分不同發酵階段無麩質谷物饅頭風味變化,采用主成分分析對揮發性風味進行分析,圖4為無麩質谷物饅頭主成分分析結果。

由圖4主成分分析可知,第一主成分貢獻率為99.86%,第二主成分貢獻率為0.13%,總貢獻率為99.99%,表明可以代表傳感器的原始信息,反應饅頭的香氣變化。與PCA法要求最低貢獻率高于70%～80%相比[23],其貢獻率較高。6組樣品無重疊部分,說明所含風味物質差異顯著,主成分分析法可以很好的區分不同發酵階段的無麩質谷物饅頭風味物質。就第一主成分分析,二次發酵面團和饅頭與其他組分的風味物質差異較大,與雷達圖結果一致。

圖4 無麩質谷物饅頭電子鼻主成分分析Fig.4 E-nose principal component analysis of gluten-free grain steamed buns

在未發酵面團中呈香物質主要是大米粉和大豆粉內揮發性風味物質。一次發酵前加入堿性蛋白酶,蛋白質被酶解后揮發性風味物質變化較大。二次發酵前加入TG酶,蛋白交聯是影響揮發性風味物質變化的主要因素[24-25],且蒸制過程中使風味物質有不同程度的損失。

2.3 SPME-GC/MS分析

2.3.1 不同發酵階段無麩質谷物饅頭的揮發性成分分析 應用GC/MS檢測,從無麩質谷物饅頭的發酵面團和成品中取樣,6種揮發性風味組分總離子流圖如圖5所示,由圖5可知,不同保留時間的峰值不同,且不同樣品之間差異較大,說明本研究中應用的分析條件可以較好的將組分分離。

由表2可以得出饅頭在發酵過程中具體的揮發性物質69種,主要包括醛類(12種)、醇類(14種)、烴類(29種)、酮類(2種)、酯類(5種)、芳香類(2種)和其他化合物(5種)。醛類和酯類化合物含有油脂和果香等香氣,是饅頭等發酵面食品中的重要香氣組成成分[26]。單純的醛類會產生刺激性氣味,微量的醛類化合物可使食品的香氣增加,如壬醛具有清香的氣味,乙醛、戊醛利于發酵氣味的產生[27]。醇類化合物對于食品的風味無明顯的影響,但能與其他物質反應形成酯類產生香氣,通常酯類具有各種果實香味[28]。烴類化合物由于閾值較高,對于氣味無較大貢獻,一般不加以分析;酮類化合物具有特殊的香氣,如果香、木香等[29]。

圖5 無麩質谷物饅頭(左)和面團(右)揮發性組分的總離子流圖Fig.5 Total ion flow diagram of volatile components of gluten-free grain steamed buns(left)and dough(right)

表2 無麩質谷物饅頭揮發性組分的分析結果Table 2 Analysis results of volatile components of gluten-free steamed buns

續表

由表2可知,無麩質谷物饅頭在發酵過程中的揮發性風味物質的相對含量和種類各不相同。在69種揮發性物質中,己醛(87.70%)、反式-2-己醛(85.24%)、水芹醛(85.14%)、苯甲醛(89.27%)、正己醇(87.67%)、1-辛烯-3-醇(75.49%)、D-檸檬烯(10.83%)、2-正戊基呋喃(6.30%)8種揮發性物質是面團和饅頭中共有的香氣;三組饅頭樣品中有14組共有揮發性物質,分別是己醛、反式-2-己醛、水芹醛、苯甲醛、正己醇、1-辛烯-3-醇、D-檸檬烯、2-正戊基呋喃、壬醛、十四烷、2-庚酮、乙酸己酯、異戊酸糠酯、川芎嗪,其相對含量分別占總相對含量的94.16%、95.65%、81.25%;三組面團樣品中有13組共有揮發性物質,分別為己醛、反式-2-己醛、水芹醛、苯甲醛、正己醇、1-辛烯-3-醇、D-檸檬烯、2-正戊基呋喃、反式-2-辛烯醛、癸醛、正己醇、正十三烷、二十烷,其相對含量分別占總相對含量的91.26%、88.00%、90.00%。6組樣品中共有物質相差較小,3組無麩質谷物饅頭共有物質相對含量相差較大,結果表明不添加酶類、添加堿性蛋白酶、添加堿性蛋白酶和TG酶制作的無麩質谷物饅頭含有部分相同的揮發性物質,但總體相對含量存在差異,說明酶的添加對于饅頭揮發性物質有一定的影響。

發酵制品中的醇類化合物主要由羰基化合物反應產生,只有在相對濃度很高或以不飽和醇類化合物的形式存在,才會對揮發性風味物質貢獻較大[30]。由表2中可以看出,6組樣品中醇類化合物相對含量均占總含量的比例最高,且一次發酵后的無麩質谷物饅頭含量最高。在無麩質谷物饅頭中,正己醇和1-辛烯-3-醇均被發現。1-辛烯-3-醇做為不飽和醇類物質,有較強的蘑菇香氣,對于發酵制品風味有較大貢獻。異戊醇只在二次發酵后的無麩質谷物饅頭中被發現,含量為0.40%。

醛類物質的相對含量在無麩質谷物饅頭中較高,由于其閾值較低,對無麩質谷物饅頭的香氣有較大貢獻[31]。己醛在樣品中均被檢測出,具有清新的風味;壬醛、反-2-辛烯醛在饅頭中均被檢出,有較為濃重的香氣;苯乙醛只在二次發酵饅頭中被檢測,其具有蜂蜜香氣。反式-2-壬烯醛只在面團中被發現,其具有脂肪香氣,蒸制使香氣減弱。酮類物質的香氣閾值較低,但種類較少且相對含量不高。在樣品中僅發現2-庚酮和3-辛烯-2-酮兩種酮類物質,二者具有特殊的果香、木香等香氣。酮類香氣多被發現于面團中,無麩質谷物饅頭中較少[32]。

酯類多由醇類發生反應而合成,在形成過程中微生物參與代謝發揮重要作用,經過酶的催化作用形成酯類,其含有果實清香[33]。無麩質谷物饅頭中乙酸己酯和異戊酸糠酯均被發現,對于饅頭香氣有較大貢獻,但結果中無大量的酯類化合物被合成,其可能是發酵時間不足所致。雜環類與芳香類化合物多被發現于饅頭中,雜環類尤以2-正戊基呋喃為主,具有果實香氣、豆香、醬香和類似于蔬菜的香氣[34]。芳香類化合物僅檢測出間二甲苯和對二甲苯兩種物質,均存在于二次發酵后的無麩質谷物饅頭中,對香氣的形成有重大影響[35]。

2.3.2 不同發酵階段揮發性物質的種類和相對含量變化 在不同發酵階段加入不同的酶,酶發揮作用后醒發的面團和蒸制的無麩質谷物饅頭含有的揮發性香氣相對含量和種類如圖6所示。

圖6 無麩質谷物饅頭中揮發性物質相對含量(A)和種類(B)的變化Fig.6 Changes in the relative content(A)and type(B)of volatile substances in gluten-free grain steamed buns

在圖6中可知,面團經酶類物質發酵作用后,醛類和醇類物質占總含量的比例較大,對面團的揮發性風味物質具有較大貢獻。在發酵過程中,酵母發揮作用,使面團中醇類物質增加,醛類物質降低,提升了面團的風味,為增強饅頭的營養成分提供了基礎[34]。此外,芳香類物質含量不斷升高,原因可能是在未加入酶類物質時,風味主要由原料粉提供。經堿性蛋白酶一次發酵后蛋白酶解作用使風味物質發生改變,經TG酶二次發酵進一步作用后使蛋白重新交聯成新的小分子肽等,使風味物質含量增多,其他類物質有明顯的改變[35]。

醒發過后的面團經蒸制形成的無麩質谷物饅頭,風味物質主要以醛類和醇類為主,且醛類、醇類和芳香類呈上升趨勢,其原因可能是在蒸制過程中,發生的生化反應使風味物質含量增加,而醇類物質在揮發后仍保持著較高的含量,與面團產生的香氣物質存在明顯差異[36]。二次發酵蒸制的饅頭,經堿性蛋白酶和TG酶協同作用后,揮發性風味物質種類最多且相對含量最高。醇類為香氣提供主要貢獻,芳香類物質相對含量高于其他組。綜上所述,堿性蛋白酶和TG酶的添加對醛類、醇類、芳香類、酯類和雜環類化合物的相對含量有明顯影響,使饅頭呈現出不同的香氣。酶在發酵過程中發揮作用,蒸制后的無麩質谷物饅頭,原有的揮發性物質在蒸制過程中發生生化反應,使揮發性風味物質發生改變,因此酶的添加對揮發性成分的種類和含量發生較大影響。

3 結論

本研究利用電子舌測定了發酵過程中無麩質谷物面團和饅頭滋味的變化,應用電子鼻判別發酵過程中的無麩質谷物面團和饅頭氣味的改變,進一步運用SPME-GC-MS測出揮發性物質的種類,共同探究出酶制劑對發酵前后的風味物質的影響。根據實驗結果表明,經過二次發酵后的無麩質谷物饅頭,饅頭的鮮味和咸味增強,苦味和澀味減弱。成品饅頭的醛類和芳香類化合物升高,提升了饅頭整體風味,其主要來源于酶制劑的作用。同時本研究可以驗證酶制劑在改良無麩質谷物饅頭風味應用上的可行性,且可以得出蒸制過程對于風味存在破壞作用。但是本研究缺少感官評價,并且未探究氨基酸經過酶制劑作用而發生的改變,為下一步研究提供基礎。