耐熱黑曲霉3.316產外切葡聚糖苷酶培養基優化及酶學性質研究

張海娟,李 軍,朱鳳妹(河北科技師范學院食品科技學院,河北省果品加工工程技術研究中心,河北秦皇島 066600)

近年來,利用纖維素酶高效分解植物纖維原料產糖生產燃料乙醇已成為國內外研究的熱點[1],但是工業生產菌株產酶活性不高仍然是目前纖維素酶生產和實際應用中存在的難題。因此,選育纖維素高產菌株是纖維素資源的生物轉化和拓展纖維素酶應用范圍的重要環節。纖維素酶是將纖維素降解為葡萄糖的酶,由內切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶組成。纖維素酶一般由多種水解酶組成,這些水解酶構成了一個復雜的纖維素酶家族[2]。纖維素酶的水解酶一般分為三類:內切葡聚糖酶,又稱為 Cx 酶或 CMC 酶,這類酶作用于纖維素分子內部非結晶區,隨機地水解β-1,4 糖苷鍵并產生大量帶有非還原末端的小分子纖維;外切葡聚糖酶,也稱為Ci酶,這類酶則是作用于纖維素線狀分子的末端,水解β-1,4 糖苷鍵,每次作用都會切下一個纖維二糖分子,所以也被稱為纖維二糖水解酶;纖維二糖酶,也稱為β-葡萄糖苷酶,將纖維二糖水解成葡萄糖[3-4]。

對于纖維素酶生產菌株的研究,一開始絕大部分集中于纖維素酶系齊全且酶活力較高的木霉如綠色木霉和里氏木霉等菌株上[5],但木霉菌發酵產物中存在多種真菌毒素,有毒性嫌疑;另一方面木霉所產的β-葡萄糖苷酶活力很低,致使纖維二糖在反應體系中積累而影響酶解效率,因而其應用范圍受到限制。而黑曲霉不產生毒素,是公認的安全微生物,并且在產纖維素酶的真菌中,黑曲霉所產纖維素酶系中以外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的活力較低[6]。我們前期對黑曲霉3.316產β-葡萄糖苷酶進行了較多的研究[7]。黑曲霉3.316產外切葡聚糖苷酶卻并未見報道。

對耐熱黑曲霉產外切葡聚糖苷酶培養基優化和酶學性質的研究,不僅為纖維素酶的食品應用提供依據,同時為構建高效表達的外切葡聚糖苷酶的基因工程菌提供了參考,還可以為蛋白質工程提供研究的前提,用于研究不同的食品工業化生產和應用需求,此類研究正在進行中[8]。本實驗通過單因素和響應面分析對黑曲霉3.316產外切葡聚糖苷酶發酵培養基條件優化及酶學性質測定,旨在提高外切葡聚糖苷酶活力,為進一步研究開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Aspergillusniger3.316 中國微生物菌種保藏中心;小麥秸稈 江蘇省連云港市東海縣;硫酸銨 天津市風船化學試劑科技有限公司;微晶纖維素 天津市光復精細化工研究所;麥芽糖 天津市科密歐化學試劑有限公司。

FJS-4磁力攪拌水浴鍋 金壇市城西富威實驗儀器廠;YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;TDL-4臺式離心機 臺北市萬方潤華實驗儀器廠;V-5100可見分光光度計 武漢高精密科學儀器有限公司;HZQ-X100恒溫振蕩培養箱 蘇州培英實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 種子培養基:FeSO4·4H2O 0.005 g,KCl 0.25 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,K2HPO40.5 g,NaNO31.5 g,蔗糖15 g,pH6.5,蒸餾水500 mL,121 ℃滅菌20 min[9]。

基礎發酵培養基:CaCl20.15 g,MgSO40.15 g,K2HPO41.0 g,(NH4)2SO42.0 g,麩皮 15 g,蒸餾水 500 mL,pH5.5,121 ℃滅菌20 min[10]。

1.2.2 酶活力的測定 酶活的測定方法參照李永博等[11]的方法:在具塞比色試管中加入1 mL粗酶液(通過基礎發酵培養基進行發酵制得),再加入1%微晶纖維素檸檬酸緩沖液2 mL,置于50 ℃水浴鍋中反應1 h后加入1.5 mL DNS終止反應,混勻后,沸水浴煮沸5 min,取出,冰浴冷卻至室溫,用去離子水定容至25 mL,在540 nm的波長下測定其吸光值。

酶活力的定義:以1 mL粗酶液1 min水解底物產生1 mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位。

計算公式[12]:

式中:IU:酶活力,U/mL;M:還原糖含量,mg;t:反應時間,min;D:稀釋倍數;Ew:粗酶液體積,mL;0.18:1 μmol葡萄糖的質量,mg

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 碳源的篩選 參照馬騰[10]的方法,在基礎發酵培養基其他成分不變情況下,改變碳源,分別以麩皮+玉米粉(1∶1),玉米纖維,麩皮+玉米纖維(1∶1),麩皮+葡萄糖(1∶1),玉米芯,麩皮,葡萄糖,小麥秸稈,麩皮+小麥秸稈(1∶1),玉米秸稈粉,麩皮+玉米秸稈粉(1∶1)為碳源,研究濃度在15 g/500 mL下不同的碳源組成發酵培養基對黑曲霉產外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.2 小麥秸稈濃度的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以10、12.5、15、17.5、20 g/500 mL小麥秸稈濃度為發酵培養基的碳源濃度,研究不同小麥秸稈濃度的發酵培養基對黑曲霉產外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.3 氮源的篩選 參照馬騰[10]的方法,以酵母浸粉、硫酸銨、蛋白胨、氯化銨、尿素、硫酸銨+尿素(1∶1)、硫酸銨+酵母浸粉(1∶1)、硫酸銨+蛋白胨(1∶1)做為氮源,在其他成分不變的情況下,以不添加氮源為空白組,研究2 g/500 mL濃度下不同氮源的發酵培養基對黑曲霉產外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.4 氮源濃度的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以1.5、1.75、2、2.25、2.5 g/500 mL硫酸銨濃度為發酵培養基的氮源濃度,研究不同硫酸銨濃度的發酵培養基對黑曲霉產外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.5 誘導物的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、水楊苷、乳糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉+麥芽糖(1∶1)、微晶纖維素+羧甲基纖維素鈉(1∶1)、羧甲基纖維素鈉+乳糖(1∶1)、微晶纖維素+麥芽糖(1∶1)、微晶纖維素+乳糖(1∶1)、微晶纖維素+水楊苷(1∶1)為誘導物,研究0.5 g/500 mL濃度下不同的誘導物對發酵培養基的影響。

1.2.3.6 誘導物濃度的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/500 mL微晶纖維素+麥芽糖濃度為發酵培養基的誘導物濃度,研究不同微晶纖維素+麥芽糖濃度對發酵培養基的影響。

1.2.4 發酵培養基組分的響應面優化試驗設計 選取小麥秸稈濃度(A)、硫酸銨濃度(B)、微晶纖維素+麥芽糖濃度(C)為響應面的三個單因素變量,建立以外切葡聚糖苷酶活力(Y)為響應值的多元性回歸模型方程。利用Design-Expert 8.0進行響應面試驗設計和分析[13-14],試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素及其水平Table 1 Levels of variables tested in Box-Benhnken design

1.2.5 酶學性質的測定

1.2.5.1 最適溫度、熱穩定性的測定 將pH5.5的粗酶液1 mL分別在30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中保溫30 min[11]后,測定外切葡聚糖苷酶的酶活力。

另一組試驗將粗酶液在30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中保溫1 h時間后,測定其剩余酶活力,研究溫度對酶熱穩定性的影響[15]。

1.2.5.2 最適pH、不同pH穩定性的測定 將1 mL粗酶液在不同pH和溫度50 ℃下反應30 min后,測定其酶活。另一組試驗將粗酶液在50 ℃條件下保溫1 h時間后,測定其原相對酶活力,測定pH對酶穩定性的影響[16]。

1.2.5.3 不同金屬離子對酶分解纖維素能力的影響 本試驗選取幾種常見金屬離子[17],對照組和樣品組在相同環境下試驗,以對照組為最高酶活(100%),其余為相對酶活力。以將1 mL粗酶液,分別加入0.5 mL不同金屬離子(KCl、NaCl、MnSO4、MgSO4、FeSO4、CuSO4、對照)溶液以及0.5 mL去離子水為對照組,保溫1 h后測定其相對酶活。以不添加金屬離子為試驗組,保溫1 h后測定其酶活力。

1.2.5.4 不同濃度的鹽溶液對酶活力的影響 將1 mL粗酶液和0.5 mL濃度為2、4、6、8、10、12 g/L的NaCl鹽溶液,在水浴鍋中反應30 min后,測定其粗酶活。以NaCl濃度為0 g/L的酶活力為100%。得出不同濃度的鹽溶液相對酶活力影響。

1.2.5.5 不同濃度的表面活性劑對酶活力的影響 將1 mL粗酶液和0.5 mL不同表面活性劑吐溫-80的濃度,反應30 min后,測定其粗酶活[16]。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010表格繪圖、SPSS 21軟件、Duncan氏多重比較、Canoco for Windows 4.5、Design-Expert 8.0進行響應面實驗設計和分析。在但因素試驗的基礎上,采用Design-Expert 8.0響應面實驗設計和分析數據結果,試驗進行測定三次平行去平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 碳源的確定 選取單一物質和混合物質為碳源,圖1結果表明小麥秸稈是黑曲霉產外切葡聚糖苷酶最適合的碳源,這可能是由于小麥秸稈作為天然的碳源,其含有較多的礦物成分和纖維素,當利用小麥秸稈作為碳源時,其誘導了黑曲霉分泌纖維素酶[18]。通過試驗得出小麥秸稈相較于其他實驗碳源表現極顯著(P<0.01)。另外小麥秸稈作為一種普遍、價廉的農業副產物,也滿足了工業上對廉價碳源的要求。

圖1 不同碳源種類對酶活力的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on enzyme activity注:不同小寫字母代表不同處理間P<0.01水平下的極顯著性差異；圖2～圖6同。

2.1.2 小麥秸稈濃度的確定 圖2結果表明,外切葡聚糖苷酶在濃度10～15 g/500 mL時,酶活力先下降后上升,但是在15～20 g/500 mL時,酶活力下降。小麥秸稈中含有豐富的纖維,當纖維素達到一定量時,能夠促進微生物生長加速產酶,但是纖維素含量太高,反而抑制微生物的生長,從而抑制產酶量[19],另外小麥秸稈的添加量太多,會影響微生物的通氧量,致使微生物不能呼吸而影響產酶結果。綜上所述，選擇15 g/500 mL為最適濃度并以此為響應面試驗中心點。

圖2 不同濃度小麥秸稈對酶活力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of wheat straw on enzyme activity

2.1.3 氮源的確定 常見的氮源種類有有機氮源和無機氮源。圖3結果表明硫酸銨是使得外切葡聚糖苷酶最適合的氮源。通過試驗得出硫酸銨相較于其他實驗氮源表現極顯著(P<0.01)。雖然硫酸銨+尿素、硫酸銨作為氮源使得酶活力增大,硫酸銨+尿素使得酶活力達到13.418 U/mL,但是氮源為硫酸銨時,酶活力達到14.195 U/mL,所以硫酸銨使得酶活力最大,最終確定選用硫酸銨為最終氮源。

圖3 不同氮源種類對酶活力的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity

2.1.4 硫酸銨濃度的確定 圖4結果表明,外切葡聚糖苷酶在1.5～2.25 g/500 mL范圍內先增后減,至2.25 g/500 mL濃度達到最大,2.25～2.5 g/500 mL范圍內降低;氮源微生物生長必不可少的物質之一,若硫酸銨含量過多,會不利于蛋白質和氨基酸的合成,對菌體細胞物質有傷害[20]。綜上所述,2.25 g/500 mL為最適濃度并以此為響應面試驗中心點。

圖4 不同濃度氮源對酶活力的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources at different concentrations on enzyme activity

2.1.5 誘導物的確定 單一誘導物和混合誘導物能夠影響黑曲霉分泌結合蛋白,從而影響轉錄基因的表達,激發特定酶的合成[21]。選用不同的誘導物加入黑曲霉培養基中,觀察黑曲霉培養產纖維素能力,試驗結果見圖5。利用微晶纖維素做誘導物對黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶影響極顯著(P<0.01),但是利用微晶纖維素+麥芽糖作為誘導物時,黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶顯著升高(P<0.01),達到12.543 U/mL,確定微晶纖維素+確定麥芽糖作為誘導物。

圖5 不同誘導物對酶活力的影響Fig.5 Effect of different induced species on enzyme activity

2.1.6 微晶纖維素+麥芽糖濃度的確定 圖6結果表明,利用微晶纖維素+麥芽糖作為誘導物,黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶在0.5～1 g/500 mL微上升,1～2 g/mL范圍內先下降后上升,在2.0～2.5 g/500 mL范圍內下降;當微晶纖維素+麥芽糖濃度在2 g/500 mL時,黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶活力最高。這可能是由于微晶纖維素+麥芽糖作為誘導物,在低濃度時,降低黑曲霉內的結合蛋白的形成,無法使基因正常表達。當微晶纖維素+麥芽糖濃度較高時,其誘導作用在菌體內占主導,因此菌體分泌外切葡聚糖苷酶活力較高。綜上所述,2.0 g/500 mL為最適濃度并以此為響應面試驗中心點。

圖6 不同濃度誘導物對酶活力的影響Fig.6 Effect of different concentrations of inducers on enzyme activity

2.2 中心組合試驗結果及響應面分析

試驗設計與結果見表2，以Y(外切葡聚糖苷酶的酶活力)為響應值的情況下,用CCD(Central Composite Design)程序進行多元回歸分析,獲得Y(外切葡聚糖苷酶活力)對A(小麥秸稈濃度)、B(硫酸銨濃度)、C(微晶纖維素+麥芽糖濃度)的三元二次回歸方程:Y=2.11-0.031A-8.875E-003B+0.063C+0.020AB-4.250E-003AC-0.049BC-0.16A2-0.12B2-0.098C2。回歸模型和方差分析見表3。

表2 中心組合設計及結果Table 2 Experimental matrix and results with CCD

表3 中心組合設計回歸模型及方差Table 3 CCD regression models and ANOVA

2.3 響應因子的水平優化

響應面圖和等高線圖如圖7所示,通過三者的兩兩交互作用確定出最優點[22]。圖中等高線反應交互作用的強弱,圓形表示不顯著,橢圓形表示顯著[23]。根據方差分析結果及各因素間響應面立體分析圖,小麥秸稈濃度(A)、微晶纖維素+麥芽糖濃度(C)對發酵產酶影響極顯著(P<0.01),硫酸銨濃度(B)影響顯著(P<0.05);同時,小麥秸稈濃度與硫酸銨濃度交互作用(圖7a)、小麥秸稈濃度與微晶纖維素+麥芽糖濃度交互作用影響不顯著(圖7b);硫酸銨濃度與微晶纖維素濃度+麥芽糖濃度交互作用影響極顯著(圖7c),硫酸銨濃度與微晶纖維素+麥芽糖濃度之間,當硫酸銨濃度一定時,外切葡聚糖苷酶的酶活力隨微晶纖維素+麥芽糖濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。

圖7 外切葡聚糖苷酶響應面圖和等高線圖Fig.7 Exoglycosidase response surface map and contour map

根據含有小麥秸稈濃度14.73 g/500 mL,硫酸銨濃度2.22 g/500 mL,微晶纖維素+麥芽糖濃度2.18 g/500 mL,CaCl20.15 g/500 mL,MgSO40.15 g/500 mL,K2HPO41.0 g/500 mL的發酵培養基,分5組進行發酵驗證。外切葡聚糖苷酶酶活力為2.120 U/mL,與模型預測的酶活力2.138U/mL的誤差值<3%。表明該模型能夠很好的預測外切葡聚糖苷酶的發酵情況。

最優培養基只影響外切葡聚糖苷酶活力的高低,所以接下來進一步研究外切葡聚糖苷酶的酶學性質。

2.4 酶學性質

2.4.1 外切葡聚糖苷酶最適溫度的測定 當作用時間、pH不變時,在不同溫度下,在恒溫水浴鍋中反應30 min后,得出如圖8。外切葡聚糖苷酶在50 ℃時,酶活最大,50 ℃以后,酶活下降趨勢明顯,由此說明,溫度對內切葡聚糖苷酶活力影響較大,最適溫度為50 ℃。

圖8 外切葡聚糖苷酶最適溫度Fig.8 Optimum tempera of exoglycosidase

2.4.2 外切葡聚糖苷酶的熱穩定性 粗酶溶液在30、40、50、60和70 ℃的水浴中溫浴60 min,并測定相對酶活力,以保溫前酶活力為100%[24],得出曲線如圖9所示。由圖9可以看出,對于外切葡聚糖苷酶來說,當溫度從30～50 ℃時,熱穩定性呈上升趨勢,并在50 ℃時達到最高,但并未達到100%,50～70 ℃時,穩定性急速下降,酶正在慢慢失活,表現出很差的熱穩定性。研究結果說明外切葡聚糖苷酶適合在較高溫環境中發揮作用,并且穩定性較強。

圖9 外切葡聚糖苷酶熱穩定性Fig.9 Thermal stability of exoglycosidase

2.4.3 外切葡聚糖苷酶最適pH的測定 通過實驗分別測定了在pH為1～8下的酶活,得出圖10所示曲線。由圖10可知,外切葡聚糖苷酶pH在1～6時,該曲線是呈上升趨勢。當pH為6時,酶的活性達到最大值。當pH>6,該曲線出現下降趨勢,酶活力逐漸減小。所以,外切葡聚糖苷酶的最適pH為6。

圖10 外切葡聚糖苷酶最適pHFig.10 Optimum pH of exoglycosidase

2.4.4 外切葡聚糖苷酶在不同pH下的穩定性 圖11說明對于外切葡聚糖苷酶來說,當pH為1～3期間,穩定性呈上升趨勢,較穩定;當pH為3～4時,穩定性逐漸下降,相對酶活力下降到原酶活的60%左右;當pH在4～6時,穩定性逐步上升,較穩定;pH在6～7期間,穩定性逐漸上升;pH在7～8時,穩定性逐漸下降。所以外切葡聚糖苷酶屬于在耐酸性環境中穩定性較強的一種酶。

圖11 不同pH下外切葡聚糖苷酶的穩定性Fig.11 Effect of different pH on stability of exoglycosidase

2.4.5 不同金屬離子對外切葡聚糖苷酶活力的影響 金屬離子會對外切葡聚糖苷酶有不同程度的影響[25]。通過與對照組的對比,FeSO4、MnSO4、CuSO4等均具有顯著性,但是由外切葡聚糖苷酶中可看出，Mn2+、Fe2+、Cu2+對該酶的酶活力有激活作用,其中Fe2+的促進作用最為明顯,FeSO4極顯著(P<0.01);Mn2+、Cu2+對該酶的促進作用較小,MnSO4、CuSO4較顯著(P<0.05);Mg2+、K+、Na+對該酶的酶活力表現出抑制作用。

圖12 不同金屬離子對外切葡聚糖苷酶活力影響Fig.12 Effects of different metal ions on activity of exoglycosidase

2.4.6 不同濃度的NaCl鹽溶液對外切葡聚糖苷酶活力的影響 由圖13可知,對于外切葡聚糖苷酶來說,當NaCl的鹽溶液中的濃度是2～6 g/L,相對酶活性正在上升,促進了酶的活性。當NaCl的鹽溶液中的濃度達到6 g/L時,相對酶活力達到最大值,當NaCl的鹽溶液中的濃度為6 g/L后,相對酶活性呈下降趨勢。當NaCl濃度達到12 g/L,開始抑制酶活性。

圖13 不同鹽濃度對外切葡聚糖苷酶活力的影響Fig.13 Effect of different salt concentration on exoglycosidase activities

2.4.7 不同濃度的表面活性劑對外切葡聚糖苷酶活力的影響 使用濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的吐溫-80,在同樣環境、不同質量濃度的表面活性劑條件下,以不加表面活性劑處理但其他保存條件相同的粗酶液的酶活做對照得出,該酶具有較高的表面活性劑耐受性。即設定吐溫-80濃度為0%的實驗組的酶活力為100%,測定其他濃度下的相對酶活[26]。由圖14可知,當表面活性劑濃度為0～0.3%時,相對酶活性增加,并且當表面活性劑濃度達到0.3%,相對酶活性達到最大值為114%;當表面活性劑濃度為0.3%～0.4%時,相對酶活性降低,并且當表面活性劑濃度達到0.4%時,相對酶活性達到最小;當表面活性劑是濃度達到0.4%后,相對酶活性又開始上升。說明表面活性劑促進了外切葡聚糖苷酶的活性。外切葡聚糖苷酶可以將原料的細胞膜破壞,釋放大量的蛋白質等碳水化合物,提高出汁率,纖維素酶將原料降解后產生能提供發酵作用的葡萄糖,具有應用發酵生產的潛力[27]。

圖14 表面活性劑濃度對外切葡聚糖苷酶活力的影響Fig.14 Effect of surfactant concentration on activity of exoglycosidase

3 結論

本研究通過利用單因素和響應面法對黑曲霉3.316產外切葡聚糖苷酶的發酵培養基條件進行優化[28],優化的培養基使得該菌株產的外切葡聚糖苷酶酶活力強,性能優良優化。耐熱黑曲霉3.316產外切葡聚糖苷酶結果表明:優化后的培養基組成為小麥秸稈14.73 g/500 mL,硫酸銨2.22 g/500 mL,微晶纖維素+麥芽糖2.18 g/500 mL,CaCl20.15 g/500 mL,MgSO40.15 g/500 mL,K2HPO41.0 g/500 mL且對于酶學性質進行測定:外切葡聚糖苷酶在高溫耐熱環境中生存,同時Fe2+有促進作用,表面活性劑對外切葡聚糖苷酶也有促進作用,在高效生產燃料乙醇下,外切葡聚糖苷酶在降解過程中發揮作用。研究試驗可能存在當酶活力達到一定時,分解產生的高濃度葡萄糖可能對產酶量下降。未來可在調控蛋白基因方面進行深度研究[29]。