木聚糖酶xynZF318在枯草芽孢桿菌WB600中的表達及發酵條件優化

田艷杰,宋兆祥,馬振武,王朝陽,徐 佳,周晨妍(新鄉醫學院生命科學技術學院,河南省合成生物學工程實驗室,河南新鄉 453003)

自然界中的可再生資源來源廣泛,含量豐富,種類多樣,木聚糖在可再生資源中歸屬于半纖維素,而半纖維素在可再生資源中僅次于纖維素,位居第二。木聚糖是異質多糖,存在于植物細胞壁中[1-3],其結構復雜,是一種多聚五碳糖,因此利用木聚糖首先需要將其降解為低聚木糖或者小分子的單糖形式,而這些能夠降解木聚糖的酶則被稱為木聚糖酶。木聚糖酶的種類很多,對木聚糖的降解發揮不同的作用,其中有一種酶能將木聚糖的主鏈結構降解,這種酶被稱為β-1,4-內切-D-木聚糖酶(endo-β-1,4-D-xylanase)[EC3.2.1.8][4-6]。目前,木聚糖酶主要被運用于包括工業、農業、食品以及飼料加工等多種領域,但是國內木聚糖酶的產量還不夠高,木聚糖酶的價格還比較高昂,因此采用多種手段提高木聚糖酶產量,顯得尤為重要[7-9]。

微生物來源的木聚糖酶種類繁多,應用廣泛,其主要利用細菌和真菌的發酵生產,因此構建產木聚糖酶工程菌有望使木聚糖酶在工業生產中有更廣泛的應用。在構建木聚糖酶工程菌的研究中,大多以大腸桿菌和畢赤酵母為宿主菌,但大腸桿菌和畢赤酵母的次級代謝產物均不能用于食品工業[10]。枯草芽孢桿菌具有生長速度較快,對營養要求較低,對農作物安全,人畜無害,對環境友好等優點,屬于食品級安全微生物[11-12],并且枯草芽孢桿菌有完善的分泌系統,可以分泌胞外酶。由于枯草芽孢桿菌的多種優點,近些年,很多研究者將其作為模式生物運用到生物研究中[13-15]。向亞萍等[16]將耐熱木聚糖酶基因xynB與質粒載體pXYNB2連接,構建重組載體并將其導入枯草芽孢桿菌Bs916中,獲得重組工程菌Bs916/pXYNB2,該工程菌能分泌表達極耐熱的木聚糖酶。Gimenez等[17]從Bacillusfirmusstrain 37中克隆得到環糖苷葡聚糖轉移酶(CGTase)基因,以pWB980作為載體,將其轉化到枯草芽孢桿菌WB800中,獲得重組工程菌。Wang等[18]構建新型鏈霉菌胰蛋白酶GM2938重組質粒,并將其轉化枯草芽孢桿菌SCK6,獲得GM2938的異源表達。Song等[19]將支鏈淀粉酶基因PUL在啟動子PHpall作用下通過穿梭載體pMA0911在枯草芽孢桿菌WB800中表達。Chen等[20]將從解淀粉芽孢桿菌中獲得的α-淀粉酶基因amy1通過載體pP43X異源表達獲得WB800重組菌,得到的重組菌比野生菌產α-淀粉酶能力提高1.4倍。通過國內外研究可以看出枯草芽孢桿菌作為宿主菌能夠獲得表達目的基因的重組工程菌,但是對枯草芽孢桿菌作為宿主菌的研究較大腸桿菌和畢赤酵母少,因此本研究利用枯草芽孢桿菌作為宿主,探索表達木聚糖酶基因的新方法。

本研究利用枯草芽孢桿菌WB600作為宿主菌,以期獲得能夠穩定產生木聚糖酶的枯草芽孢桿菌重組工程菌。枯草芽孢桿菌作為微生物研究中的模式生物,是一種可以分泌胞外酶的菌株,屬于食品級安全微生物,將實驗室獲得的木聚糖酶基因xynZF-318通過與高表達載體pWB980相連,并將其電擊轉化到枯草芽孢桿菌WB600中,獲得枯草芽孢桿菌重組工程菌,并對其產酶條件進行優化有利于木聚糖酶在工業中的獲取與應用。本研究有望為木聚糖酶的工業應用尤其是食品工業應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WB600、pWB980表達載體 北京天恩澤生物科技有限公司;質粒pET28a-xynZF-318 作者所在實驗室前期構建;DNA 質粒小量抽提試劑盒、卡那霉素(Kan)、DNA 膠回收試劑盒 上海生工生物工程有限公司;DNA聚合酶、T4DNA Ligase和限制性內切酶等 TaKaRa公司;DNA Marker MBI公司;蛋白質標椎分子量 索萊寶生物科技有限公司;樺木木聚糖 Sigma 公司;蛋白胨、酵母提取物 賽默飛世爾科技公司;瓊脂粉 北京奧博星生物科技有限公司;其余生化試劑 均為國產分析純產品。

C1000梯度PCR擴增儀 美國Bio-Rad公司;振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司;DYY-2穩壓穩流電泳儀 北京市六一儀器廠;DC-0506fE溫恒槽 上海比朗儀器有限公司;HZQ-F160A恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;Neofuge 23R高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物設計 根據作者所在實驗室從黑曲霉中克隆獲得的木聚糖酶xynZF-318基因序列(Genbank:JQ700383)及pWB980高表達載體的多克隆位點,設計出兩條引物:

xyn318-KCF:5′-CCCAAGCTTTTAATCCCGT CTTCCCCGGCT-3′(HindⅢ酶切位點)

xyn318-KCR:5′-ACGCGTCGACCTACGATAAA GTCCTCC-3′(SalI酶切位點),由金唯智生物公司負責合成。

1.2.2 目的基因xynZF-318表達載體構建 將上下游引物xyn318-KCF和xyn318-KCR以重組質粒pET28a-xynZF-318為模板,進行PCR的擴增。其擴增條件[21]:先預變性,條件為94 ℃,2 min;然后進行變性,條件為94 ℃,30 s;退火,條件為52 ℃,45 s;延伸,條件為72 ℃,1 min;該過程進行35個循環,之后再延伸,條件為72 ℃,10 min。將擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳,對目的條帶割膠回收,將回收后的產物和pWB980質粒分別用限制性內切酶HindⅢ和SalⅠ,在37 ℃條件下進行雙酶切反應,并將雙酶切反應后的pWB980表達載體和目的基因分別用膠回收試劑盒進行割膠回收,然后用T4DNA Ligase在16 ℃條件下過夜連接。將連接后的pWB980/xynZF-318轉入WB600感受態細胞中,獲得轉化子,該過程通過電轉儀用電擊轉化的方法進行,電擊轉化的條件:2.5 ms,1.5 kV。轉化子經Kan抗性平板篩選后獲得重組菌WB600/pWB980/xynZF-318。(本實驗所加Kan抗性的終濃度為100 μg/mL)。

1.2.3 重組木聚糖酶陽性克隆子驗證 提取工程菌WB600/pWB980/xynZF-318質粒,并將其作為模板,Xyn318-KCF和Xyn318-KCR作為上下游引物,對其進行PCR擴增驗證。

1.2.4 重組木聚糖酶陽性克隆子篩選 將陽性克隆子接種于LB小試管中,過夜培養,并取少量種子液接種于木聚糖固體平板上,37 ℃培養3～5 d,將其用剛果紅溶液染色1 h,用1 mol/L NaOH溶液脫色,觀察培養基產生透明圈情況。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳檢測 將工程菌WB600/pWB980/xynZF-318種子液轉入30 mL/250 mL的LB錐形瓶中進行發酵培養,37 ℃培養6 d后,將酶液收集,5000 r/min離心20 min,取其上清,在-20 ℃凍存后,利用冷凍真空干燥機進行干燥,使上清濃縮至1 mL,濃縮后的蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳后,用考馬斯R-250染色,脫色后檢測目標蛋白的表達情況。

1.2.6 木聚糖酶活力測定 采用DNS法,即3,5-dinitrosalicylic acid測定木聚糖酶活力[22]。以1 min產生1 μmol的還原性木糖所需要的酶量作為一個酶活力單位,即U/ml。

1.2.7 重組木聚糖酶搖瓶發酵工藝優化 對枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318進行搖瓶發酵工藝優化。以培養溫度37 ℃、接種量1%、裝液量30 mL、種齡10 h、轉速220 r/min、發酵時間120 h為基礎培養條件,首先采用單因素的方法優化重組菌產酶條件。依次對菌種的接種量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、250 mL錐形瓶的裝液量(25、30、40、50、60、70 mL)、菌種的種齡(10、12、14、16、18 h)、培養溫度(30、32、35、37、39 ℃)、搖床轉速(120、140、160、180 r/min)以及發酵時間(48、72、96、120、144、168、192 h)進行優化,每次均以獲取的最佳條件作為定量值,以所要優化的單因素條件作為變量,獲得單因素優化的最適條件。

在單因素優化最佳結果的基礎上,以接種量(%)、裝液量(mL)和種齡(h)為自變量,以酶活力(U/mL)為響應值,對枯草芽孢桿菌重組工程菌進行響應面實驗[23-24],確定其搖瓶的最優發酵工藝條件。

表1 實驗因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

1.3 數據處理

每個實驗設計3個重復實驗,使用Design Expert 8.0軟件設計影響酶活力表達量的各項組合實驗。

2 結果與分析

2.1 重組工程菌的構建

按1.2.2方法PCR擴增的目的條帶位置如圖1所示。然后將其割膠回收,與高表達載體pWB980一起雙酶切,條帶如圖2所示。酶切產物連接液經電轉儀電擊轉化進枯草芽孢桿菌WB600感受態細胞,用含有Kan抗性平板篩選轉化子,獲得枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318。

圖1 基因xynZF-318的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of xynZF-318 gene注：M：DNA Marker；1：PCR擴增得到的xynZF-318。

圖2 pWB980質粒與xynZF-318基因雙酶切Fig.2 Double digestion of pWB980 vector and xynZF-318注：M：DNA Marker； 1、2、3：質粒pWB980；4、5：基因xynZF-318片段。

2.2 重組工程菌基因表達驗證

重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318質粒提取如圖3所示。以從工程菌中提取的質粒為模板,Xyn318-KCF和Xyn318-KCR作為上下游引物,經PCR擴增獲得條帶如圖4所示。圖3、圖4說明重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318基因構建成功。

圖3 重組質粒提取Fig.3 Extraction of the recombinant plasmid注：1：pWB980質粒；2：pWB980/xynZF-318。

圖4 基因xynZF-318的PCR擴增驗證Fig.4 PCR validation of xynZF-318 gene注：M：DNA Marker；1：PCR擴增得到的xynZF-318。

2.3 重組工程菌陽性克隆子篩選

重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318經木聚糖固體培養基上培養3～5 d之后,用剛果紅溶液染色,由圖5可知,WB600/pWB980/xynZF-318菌落經剛果紅染色時,出現明顯透明圈,而同步培養的WB600菌落則沒有出現,說明該重組工程菌能產生木聚糖酶。

圖5 剛果紅染色篩選重組工程菌Fig.5 Congo red staining for screening recombinant engineering bacteria注：1：WB600/pWB980/xynZF-318菌落；2：WB600菌落。

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳檢測

通過SDS-PAGE凝膠電泳圖片觀察XynZF-318目的基因條帶,由圖6可知,在33 kDa處有明顯的條帶,該條帶位置與XynZF-318的蛋白分子質量相同[25]。

圖6 重組XynZF-318的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of XynZF-318注：M: Pageruler prestained protein ladder；1:WB600蛋白條帶；2:WB600/xynZF-318條帶。

2.5 重組菌木聚糖酶活力測定

由表2可知,本研究成功獲得產木聚糖酶枯草芽孢桿菌重組工程菌,重組菌粗酶液酶活力較野生菌WB600提高了1.91倍。粗酶液測定時重組菌WB600/pWB980/xynZF-318的顏色比WB600 粗酶液的顏色明顯加深,說明重組菌的木聚糖酶表達較好。

表2 重組菌酶活測定Table 2 Enzyme activity determination of recombinant bacteria

2.6 重組菌WB600/pWB980/xynZF-318搖瓶發酵工藝研究

2.6.1 單因素實驗結果 對重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318進行單因素發酵條件優化,獲得最適條件如圖7所示。圖7a所示,接種量為1.5%時相對酶活力最高,當接種量小于1.5%時,重組菌的相對酶活力僅為最高酶活力的40%,當接種量大于1.5%時,相對酶活力呈遞減趨勢。圖7b所示,裝液量為30 mL時相對酶活力最高,隨著裝液量的逐漸增加,菌體的溶氧量逐漸減少,因此產酶活力呈下降趨勢。圖7c所示,種齡為12 h 時相對酶活力最高,當種齡小于12 h時相對酶活力增加較快,當種齡大于12 h時,其相對酶活力逐漸減少但減少幅度較小,說明種齡增加對重組菌產酶活力影響較小。圖7d所示,培養溫度為37 ℃時,相對酶活力最高,當溫度低于37 ℃時,重組菌的相對酶活力較低,說明溫度低于37 ℃時重組菌幾乎沒有酶活力。圖7e所示,轉速為160 r/min時相對酶活力最高,當轉速小于或大于160 r/min時,相對酶活力均下降,但總體下降趨勢較小,說明轉速對重組菌產酶影響不大。圖7f所示,最佳發酵時間為168 h,隨著發酵時間的延長,重組菌酶活力逐漸增加,當發酵時間為168 h時酶活力達到最大。

圖7 單因素實驗結果Fig.7 Single factors experiments results

2.6.2 響應面實驗結果分析 在前期單因素實驗基礎上,根據搖瓶發酵單因素優化實驗可以確定,重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318的最佳的搖瓶發酵條件為:接種量1.5%;裝液量30 mL;種齡12 h;轉速160 r/min;培養溫度37 ℃;發酵時間168 h。根據單因素數據分析,培養溫度較低時重組菌幾乎沒有酶活力,而轉速對酶活力的影響較小,本研究以接種量、裝液量、種齡為自變量設計響應面實驗因素水平表,進行響應面實驗操作,以木聚糖酶活力作為該實驗因變量,對該工程菌進行測定,如表3所示。運用Design Expert 8.0進行分析,如圖8所示,對該實驗結果進行統計學分析,通過最小二乘法回歸方程式分析得到枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318產木聚糖酶活力R與接種量A、裝液量B、種齡C的二次多項回歸模型:酶活力(R)=0.24-0.01A-0.091B-0.01C+0.007AB+0.01AC+0.007BC-0.018A2+0.045B2-0.006C2。對該回歸方程進行方差分析,由表4可知,模型的P<0.01,說明該實驗模型極顯著;失擬項不顯著(P=0.1262>0.05),決定系數R2=96.02%,說明該回歸方程的擬合度良好,該模型成立。方程的一次項中B(P<0.0001)極顯著,說明裝液量對工程菌產酶活力影響極顯著,根據F值大小可以判斷本實驗所采用的3個因素對工程菌產酶活力影響的主次順序為B(裝液量)>A(接種量)>C(種齡);二次項B2極顯著(P<0.01)。

表3 響應面分析試驗結果Table 3 Experimental results of response surface analysis

圖8 兩因素交互作用對響應值影響的響應面圖Fig.8 Response surface diagram of the inflnence of the interaction of two factors on the response value

表4 響應面模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface model

由圖8可知,A、B、C三個影響因素對酶活力的影響均不同,根據二次多項回歸方程、單因素優化結果可以得出預測最優水平:接種量:1.23%、裝液量:20.05 mL、種齡:10.93 h培養溫度為37 ℃、搖床轉速為160 r/min、發酵時間為168 h,在此條件下重組菌酶活力預測值可達0.382 U/mL,由于實際操作可行性選取最優的發酵條件為:接種量為1.2%、裝液量為20 mL、種齡為11 h、培養溫度為37 ℃、搖床轉速為160 r/min、發酵時間為168 h。經重復實驗驗證后,得到實際酶活力為0.359 U/mL,比預測值(0.382 U/mL)小6.0%,說明此回歸方程較好地反應了實際情況。但是本研究與向亞萍等[16]研究相比也存在表達過程中質粒拷貝數較低,以及酶穩定性較差等問題,針對現存的問題,作者后續將積極尋找解決方案。

3 結論

本研究構建枯草芽孢桿菌重組工程菌WB600/pWB980/xynZF-318,該工程菌能有效產生木聚糖酶。由單因素和響應面結果分析最優的發酵條件為:接種量1.2%、裝液量20 mL、種齡11 h、培養溫度37 ℃、搖床轉速160 r/min、發酵時間168 h。經重復實驗驗證后,得到實際酶活力為0.359 U/mL。本研究成功獲得產木聚糖酶枯草芽孢桿菌重組工程菌,菌株的產酶活力較野生菌WB600(0.098 U/mL)提高了2.66倍。

本研究成功獲得產木聚糖酶枯草芽孢桿菌重組工程菌,菌株的產酶活力較野生菌有明顯提高,并且枯草芽孢桿菌能直接將木聚糖酶分泌到胞外,有利于木聚糖酶的分離與提取,為木聚糖酶在枯草芽孢桿菌宿主菌中獲得表達提供思路,有望為木聚糖酶的工業應用尤其是食品工業應用拓寬道路。