板栗種仁多糖的提取純化及體外抗腫瘤活性篩選

何俊平,李曉菁,孟 迪,宋磊肖,楊越冬,牛 奎(河北科技師范學院化學工程學院,河北省天然產物活性成分與功能重點實驗室,河北秦皇島 066004)

天然多糖是一類結構多樣的生物大分子,也是生物體內重要的結構材料和能量儲存單元。近幾十年來,由不同植物、動物和微生物中分離出的多糖在抗氧化[1]、抗凝血[2]、抗腫瘤[3]和刺激免疫[4]等方面表現出的藥理學活性正逐漸引起關注。其中,香菇多糖[5]、云芝多糖[6]和裂褶菌多糖[7]等食用菌多糖已經在體外、體內和臨床試驗中體現出顯著的抗腫瘤免疫調節功效,相關的抗癌藥物也已在國內外上市。而且多糖的來源也是促成其產業化應用的一個不可或缺的因素,因此發掘一種資源豐富、廉價易得且具有突出抗腫瘤生物活性的多糖將對抗癌天然藥物領域的開發和應用產生深遠的影響。

作為山毛櫸科栗屬植物的典型代表,板栗(CastaneamollissimaBlume)含有豐富的淀粉、蛋白質、脂肪、維生素和氨基酸等可供人體吸收和利用的營養成分,是我國最重要的干果和木本糧食作物之一。不僅如此,板栗還具有良好的保健功能和藥用價值。中醫學認為多食板栗種仁可益氣健脾、補腎強筋、活血消腫,而板栗總苞、花、葉,以及栗樹皮和栗樹根常被民間用來治療折傷腫痛、反胃、泄瀉、凜癰等常見癥狀。目前,已有研究表明板栗不同植物組織中含有的小分子多酚類物質具有抗氧化[8]、抗菌[9]、抗病毒[10]、抗腫瘤[11]、降血糖和降血脂[12]等生物活性。借助超聲輔助法提取的板栗多糖被證實具有優異的抗氧化活性[13]和酪氨酸酶抑制活性[14],以熱水法提取的板栗多糖被證實具有抗疲勞作用[15]和促進小鼠白細胞增長的作用[16],而以亞臨界萃取法提取的板栗多糖具有較強的自由基清除活性[17]。

燕山板栗隸屬于我國的華北品種群,有著歷史悠久、栽培面積廣、總產量大的特點,已成為燕山地區農民增收的重要支柱產業。燕山板栗的種仁以其肉質細膩、風味香甜、糯性強、營養價值高等特點享譽國內外。然而目前市場上的相關產品仍以糖炒板栗和板栗果脯為主,板栗產業面臨著精深加工產品少、產品附加值低的發展瓶頸。本研究擬采用加壓溶劑萃取法提取燕山板栗種仁中的多糖,優化提取工藝并對多糖進行性質表征和抗腫瘤活性篩選。研究旨在發掘燕山板栗種仁多糖的生物活性,為實現燕山板栗在保健食品和特效藥物領域的高質化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕山“遵玉”板栗 采自河北省秦皇島市青龍滿族自治縣,經過人工剝皮后,得到的栗仁于60 ℃充分干燥,再經粉碎機細碎,將板栗粉過60目篩,置于-80 ℃超低溫冰箱內儲存備用;AB-8大孔吸附樹脂 天津市光復精細化工研究所;DEAE-52纖維素樹脂 英國Whatman公司;葡聚糖分子量標準品 美國APSC公司;單糖分析標準品 美國Sigma-Aldrich公司;BEL-7402人肝癌細胞株 美國ATCC細胞庫;HCT-116人結腸癌細胞株、HepG2人肝癌細胞株、BGC-823人胃癌細胞株、NCI-H1650人非小細胞肺癌細胞株、A2780人卵巢癌細胞株、HL-60人原髓細胞白血病細胞株、A-549人非小細胞肺癌細胞株 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;實驗用水(Milli-Q超純水) 美國Milli-Q Biocel系統制備;其他試劑(分析純) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司。

APLE-3000全自動加壓溶劑萃取儀(配有100 mL萃取池) 北京吉天儀器有限公司;N-1100旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社;ALPHA 2-4 LD plus冷凍干燥機 德國Marin Christ公司;UV-5500紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;SU8010場發射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;TENSOR27傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司;Agilent 1260 infinity高效液相色譜系統(配有示差折光檢測器) 美國Agilent公司;ICS-5000離子色譜系統(配有脈沖安培檢測器) 美國Thermo Fisher公司;PowerWave XS2全波長酶標儀 美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 板栗種仁多糖的提取 將一定質量的板栗粉與等體積的硅藻土混合,然后將混合物裝入100 mL不銹鋼萃取池中,用硅藻土填滿萃取池后置入加壓溶劑萃取儀。以水為溶劑,設定不同的提取溫度、壓力、時間和靜態萃取循環次數。萃取完成后將萃取液離心、過濾并記錄澄清液體積,將澄清液稀釋一定倍數后采用苯酚-硫酸法[18-19]測定粗提物中多糖的含量。配制11個濃度梯度的葡萄糖標準溶液(濃度范圍:0～0.1 mg/mL),得到多糖質量濃度ρ和490 nm處吸光度(OD)值的線性回歸曲線,其方程為OD490 nm=7.7582ρ-0.0035,R2=0.9992。多糖的得率計算如下:

式中:Y表示多糖的得率,%;C表示對照標準曲線得到的多糖質量濃度,mg/mL;V表示澄清液體積,mL;N表示澄清液稀釋倍數;m表示所稱取板栗粉的質量,mg。

1.2.2 單因素實驗 以多糖的得率為指標,分別考查萃取投料量、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和循環次數五個因素對多糖得率的影響。固定萃取溫度為60 ℃,萃取時間為8 min,萃取壓力為6 MPa,循環次數為3次,考察投料量(5、10、15、20、25 g)對多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取溫度為60 ℃,萃取時間為8 min,萃取壓力為6 MPa,考查循環次數(1、2、3、4、5、6)對多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取時間為8 min,萃取壓力為6 MPa,循環次數為3次,考查萃取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取溫度為60 ℃,萃取壓力為6 MPa,循環次數為3次,考查萃取時間(4、6、8、10、12 min)對多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取時間為8 min,萃取溫度為60 ℃,循環次數為3次,考查萃取壓力(4、5、6、7、8 MPa)對多糖得率的影響。每項實驗平行重復3次。

1.2.3 響應面試驗 結合單因素實驗結果、實際提取效率和原料利用率,固定萃取投料量為10 g、循環次數為3次,以多糖得率Y為響應值,選擇萃取溫度(A)、萃取時間(B)和萃取壓力(C)為自變量,應用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行三因素三水平的Box-Behnken響應面法試驗設計。分別以-1、0、1來表示低、中、高3水平,每個因素的最優條件作為中心點,響應面因素與水平見表1。

表1 響應面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 板栗種仁多糖的純化 按照響應面試驗得到的最佳提取條件提取板栗種仁粗多糖。多糖的純化參考文獻[20]的方法并做適當改進。將粗多糖溶液與Sevag試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1,V/V)按1∶1的體積比在分液漏斗中混合、振蕩,靜置分層后除去變性蛋白和有機層,再加入與水層體積相同的Sevag試劑,反復多次,直至沒有蛋白沉淀出現為止。將上清液濃縮后,加入4倍體積的95%乙醇沉淀多糖,收集后經冷凍干燥得到脫蛋白多糖。將脫蛋白多糖溶解于少量水中,以水為洗脫劑利用AB-8大孔吸附樹脂去除多糖中的色素,流速設定為1.0 BV/h,5.0 mL/管收集洗脫液并借助苯酚-硫酸法檢測各管多糖含量。將含有多糖的洗脫液合并、濃縮,用水反復透析并冷凍干燥,得到純化多糖。

1.2.5 YCP-H的分級制備 多糖的分級參考文獻[21]的方法并做適當改進。將純化多糖配成1.0 mg/mL的溶液,過0.45 μm濾膜后利用高效體積排阻色譜(HPSEC)分析多糖的分子量分布。葡聚糖標樣:DXT3K、DXT20K、DXT102K、DXT300K、DXT1185K、DXT2500K和DXT5900K;色譜柱:Agilent PL aquagel-OH MIXED-H柱(300 mm×7.5 mm,8 μm,測量范圍:6～10,000 kDa);上樣量:20 μL;流動相:水;流速:0.8 mL/min;柱溫:35 ℃。根據純化多糖分子量分布的測定結果,利用制備型高效體積排阻色譜(prep HPSEC)對多糖進行分級。色譜柱:Agilent PL aquagel-OH MIXED-H column(300 mm×25 mm,8 μm);上樣量:200 μL;流動相:水;流速:9.0 mL/min;柱溫:35 ℃。將高分子量組分合并收集、濃縮,經冷凍干燥后得到白色絮狀多糖YCP-H。

1.2.6 板栗種仁多糖的理化性質分析

1.2.6.1 掃描電鏡(SEM)觀察多糖形貌 將多糖粉末均勻涂覆在貼有雙面碳導電膠帶的電鏡進樣臺上,真空條件下噴金處理后利用SEM進行觀察。放大倍數:500倍;加速電壓:10.0 kV。

1.2.6.2 紅外光譜(FTIR)分析 取1 mg多糖樣品與100 mg KBr粉末在研缽中混勻研磨,置于模具內壓成1 mm厚透明薄片后測試。掃描范圍:500～4000 cm-1;掃描間隔:2 cm-1。

1.2.7 板栗種仁多糖的單糖組成分析

1.2.7.1 樣品的水解 取5 mg樣品加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液,于120 ℃水解2 h。冷卻后通入氮氣吹干,加入2 mL甲醇清洗,再吹干。重復清洗3次后加入1 mL水溶解,轉入色譜瓶中待測。

1.2.7.2 標準母溶液的配制 取巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、核糖(Rib)標準品各100 mg溶解于8 mL水中,然后定容至10 mL,配制成10 mg/mL的混標母液。將母液稀釋100倍后,再梯度稀釋至1、5、10、20、30、40、50、60 μg/mL。

1.2.7.3 測定方法 利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法(HPAEC-PAD)檢測樣品的單糖組成和含量,根據色譜峰的保留時間對單糖組成進行定性,外標法定量。離子色譜條件:色譜柱:DionexTMCarboPacTMPA20(150 mm×3 mm);檢測器:脈沖安培檢測器;電極:金電極;進樣量:20 μL;流動相:H2O,0.1 mol/L NaOH,0.1 mol/L NaOH/0.2 mol/L NaAC;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;數據分析:Chromeleon 7.2色譜工作站。

1.2.8 體外抗腫瘤活性篩選

1.2.8.1 細胞培養 腫瘤細胞株用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(含青霉素100 U/mL,鏈霉素100 μg/mL)于37 ℃、含5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱內常規培養。

1.2.8.2 MTT法細胞增殖抑制實驗 取對數生長期的腫瘤細胞株制備細胞混懸液,顯微計數,調整細胞濃度,按1×103個/孔接種到96孔板,在37 ℃培養24 h。移除培養液,以PBS緩沖液沖洗3次。設置藥物組(樣品濃度分別為0.1、1、10、100和1000 μg/mL的系列溶液)、空白對照組(只加培養基)和陽性藥對照組(紫杉醇濃度分別為0.1、1、10、100和1000 μg/mL的系列溶液)。在96孔板中分別加入各組溶液,每個濃度做3個重復。將各組樣品置于培養箱內培養96 h,棄去培養液,然后加入100 μL 0.4 mg/mL的MTT溶液,繼續孵育4 h。移除上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,溫和振蕩10 min后用酶標儀檢測570 nm處的OD值。采用下式計算各組抑制率(I):

式中:ODs表示藥物組或陽性藥對照組OD值的平均值;ODc表示空白對照組OD值的平均值。利用SPSS軟件計算半數抑制濃度(IC50)值。

1.3 數據處理

實驗結果取三次平行實驗的平均值,數據表示為Mean±SD。響應面試驗數據采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行二次回歸分析及方差分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.0001表示差異高度顯著。采用SPSS 21.0和Origin 2018軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 投料量對多糖得率的影響 如圖1所示,板栗種仁多糖的得率隨板栗粉投料量的增加呈總體下降趨勢,當投料量大于15 g時下降明顯。這是由于萃取池體積固定,投料量的增大會降低水料比,當可溶性多糖在水中達到飽和后,溶劑的減少會導致多糖提取不徹底。綜合提取效率和原料的利用率,選取板栗粉的投料量為10 g進行下一步試驗。

圖1 投料量對板栗種仁多糖得率的影響Fig.1 Effect of the amount of raw materials on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.2 循環次數對多糖得率的影響 循環次數對多糖得率的影響見圖2,循環次數由1次增加至3次可以使多糖得率由14.31%大幅升至19.08%,而繼續增加循環次數對得率影響不大,結合實際提取效率選定循環次數為3次。

圖2 循環次數對板栗種仁多糖得率的影響Fig.2 Effect of cycle times on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.3 萃取溫度對多糖得率的影響 如圖3所示,多糖得率隨萃取溫度的升高先增加后減小。當溫度為60 ℃時,多糖得率達到試驗最大值。這是因為適當升高溫度能夠提高傳質速度并且增加多糖的溶解度,而溫度過高可能導致多糖的降解,從而降低了多糖的浸出率[22-23]。

圖3 萃取溫度對板栗種仁多糖得率的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.4 萃取時間對多糖得率的影響 圖4給出了萃取時間對多糖得率的影響,萃取時間4～8 min內對多糖得率影響較大,隨提取時間延長,多糖得率顯著增加(P<0.05),而萃取時間8～12 min內多糖得率隨時間增加呈現減小的趨勢。分析原因可能是萃取時間的適當延長有利于多糖的充分溶出,但提取時間過長會引起多糖降解,使得多糖得率出現下降[24-25]。

圖4 萃取時間對板栗種仁多糖得率的影響Fig.4 Effect of extracting time on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.5 萃取壓力對多糖得率的影響 從圖5中可以看出,提高萃取壓力使多糖得率先增加后減小,壓力為6 MPa時達到最大值。這是由于壓力的提升能提升溶劑分子對板栗種仁細胞壁的破壞作用,同時增大多糖的溶解度,而過高的壓力會致使種仁微粉聚集,減小其與溶劑接觸的比表面積,從而降低多糖的得率[26-27]。

圖5 萃取壓力對板栗種仁多糖得率的影響Fig.5 Effect of extracting pressure on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.2 響應面法優化提取工藝

根據Box-Behnken響應面法設計進行17組試驗,對應多糖得率Y的試驗值和預測值見表2。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對試驗結果進行回歸分析,并對各因素進行回歸擬合后,得到多糖得率對萃取溫度(A)、萃取時間(B)和萃取壓力(C)的三元二次回歸方程:Y=19.72+0.18A+1.04B-0.46C-0.21AB+0.25AC+0.062BC-1.49A2-2.08B2-2.78C2

表2 Box-Behnken試驗設計的自變量水平與對應的多糖得率Table 2 Variable levels of Box-Behnken design and the response values for the extraction yield of polysaccharides

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

由模型方程得到的響應曲面和等高線圖能夠直觀反映各因素及其交互作用對最終響應值的影響。圖6分別展示了萃取壓力、萃取時間和萃取溫度位于中心水平時,其他兩因素的交互作用對多糖得率的影響。由圖6可知,多糖得率隨其他兩因素的增加都呈現先上升后下降的趨勢,即均存在與方程極大值對應的響應面最高點。與圖6c相比,圖6a和圖6b中響應曲面的坡度相對較緩,說明與萃取時間和萃取壓力的交互作用對響應值的影響相比,萃取時間與萃取溫度、萃取壓力與萃取溫度的交互作用對多糖得率的影響相對較小[28-29]。從圖6a和圖6b中沿坐標軸的等高線密度可知,沿萃取時間和萃取壓力軸向等高線的密度均比沿溫度軸向等高線的密度大,同樣說明萃取溫度的變化對多糖得率的影響相對較小[30-31]。而圖6c中沿時間軸向等高線的密度比沿壓力軸向等高線的密度大,說明與萃取壓力相比,萃取時間的變化對多糖得率的影響較大。由響應面和等高線圖所得結論與表3一致。

圖6 不同因素相互作用對板栗種仁多糖得率的響應曲面和等高線Fig.6 Response surfaces and contours showing the interactive effects of different factors on yield of polysaccharides in chestnut kernel

運用Design-Expert 8.0.6.1軟件對試驗數據進行優化預測,得到提取板栗種仁多糖的最佳工藝參數為:萃取溫度60.68 ℃、萃取時間8.98 min、萃取壓力5.84 MPa,對應多糖得率的最大預測值為19.87%?？紤]到儀器設備的可操作性,將最佳提取工藝參數調整為:萃取溫度60 ℃、萃取時間9 min、萃取壓力6 MPa。在此條件下進行3次平行驗證試驗,得到的多糖得率為19.78%±0.27%,與模型預測值較接近。與其他提取方法相比,加壓溶劑提取法有著較高的多糖得率[32-33],這可能是由于高壓條件提高了水對細胞的穿透力和破壞力,加速水分子突破板栗種仁細胞壁的致密結構,從而有效加快多糖的釋放。響應面試驗設計與分析的結果表明,借助該響應面模型優化得到的提取參數基本準確可靠,對實際應用具有較高的參考價值。

2.3 分子量的測定

在最佳工藝參數下提取板栗種仁粗多糖,經過去蛋白、脫色素、透析后得到純化多糖。圖7給出了純化多糖的HPSEC洗脫曲線以及葡聚糖標準品(重均分子量Mw分別為3.65,20.1、102、291.6、1185、2500、5900 kDa)的標準矯正曲線。根據標準品的保留時間(t)及Mw,以lg Mw對t作圖,得到標準曲線的線性方程lg Mw=-0.9388t+13.3165,其中R2=0.9950,表明葡聚糖對照品的Mw在3.65～5900 kDa的范圍內與t呈良好的線性關系。由樣品的HPSEC洗脫曲線可知,板栗種仁純化多糖的分子量分布較寬,最高分子量大于5900 kDa,這可能是由于與傳統的熱水提取、酸堿提取等方法相比,加壓溶劑萃取法的條件相對溫和,可以有效地避免板栗種仁中高分子量多糖的降解,因此能夠最大限度地萃取各水溶性多糖組分[34]。在標準曲線的可測范圍內檢測到t1=7.86 min與t2=9.85 min兩個主要的多糖峰,響應信號最大值對應的Mw分別為866和12 kDa。依據HPSEC的測定結果,實驗借助prep HPSEC對純化多糖進行分級,收集t在6.97～8.50 min內的高分子量多糖級分,冷凍干燥后制備YCP-H。對照標準曲線方程計算可得YCP-H的Mw分布范圍為217～5900 kDa。

圖7 HPSEC的標準矯正曲線和板栗種仁純化多糖的HPSEC洗脫曲線Fig.7 Standard calibration curve of HPSEC and the HPSEC elution profile of the purified polysaccharides in chestnut kernel

2.4 微觀形貌分析

將板栗種仁多糖在不同純化階段所得到的樣品進行掃描電鏡觀察,放大500倍后的電鏡照片見圖8。由圖8a可以看出,粗多糖由大量形態不規則、尺寸不均一的顆粒組成,顆粒間有著明顯的團聚現象。圖8b顯示,經過去蛋白、脫色素和透析后的純化多糖顆粒尺寸相對均一,且團聚現象減輕。相比之下,圖8c則表明樣品YCP-H中存在大量的纖維狀聚集態結構,部分纖維顆粒的長度可以達到100 μm以上。

圖8 板栗種仁多糖的掃描電鏡照片(500×)Fig.8 SEM photographs of polysaccharides in chestnut kernel(500×)注:a:粗多糖;b:純化多糖;c:YCP-H(板栗多糖的高分子量組分)。

2.5 紅外光譜測試

圖9所示為樣品YCP-H的紅外光譜。YCP-H具有典型的多糖特征吸收峰,其中,位于3388 cm-1處較寬的吸收帶代表多糖中O-H的伸縮振動,位于2934和1418 cm-1處的吸收峰分別來自于多糖中C-H的伸縮振動和彎曲振動[35]。位于1616 cm-1處較尖銳的吸收峰對應于羧基中C=O的不對稱伸縮振動,同時1366 cm-1處出現了質子化羧基中C-O的伸縮振動峰,1262 cm-1處出現了羧基中O-H的彎曲振動峰,證實了多糖中糖醛酸的存在。在800～1200 cm-1的多糖指紋區,1046 cm-1處的吸收峰來自于糖苷鍵中C-O的伸縮振動,而1018 cm-1處的吸收峰則對應吡喃糖環中C-O-C的特征吸收。光譜中在926 cm-1處出現了吡喃糖β-端基差向異構的C-H變角振動峰,在770 cm-1處則出現了吡喃環的對稱伸縮振動峰,由此可以判斷YCP-H中含有β-吡喃糖苷鍵[36]。此外,位于866和814 cm-1處的吸收峰與甘露糖的特征吸收一致[37],而616 cm-1處的吸收峰對應O-H的面外彎曲振動,550 cm-1處的吸收峰來自C-C-O的彎曲振動。YCP-H的紅外光譜證實了該多糖是具有β-吡喃構型的酸性多糖,單糖組成中可能含有甘露糖。

圖9 YCP-H的紅外光譜圖Fig.9 FTIR spectrum of YCP-H

2.6 單糖組成測試

將YCP-H在酸性條件下水解后,利用HPAEC-PAD法分析該多糖的單糖組成,標樣和所測樣品的色譜曲線見圖10。通過對比YCP-H和標樣的保留時間,可知YCP-H中含有6種單糖,分別為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。定量分析得到上述單糖的摩爾比分別為1.00∶36.06∶34.93∶15.12∶10.05∶3.16。結果表明,YCP-H主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖組成,另外含有少量的巖藻糖和甘露糖。

圖10 YCP-H的單糖組成及含量Fig.10 Composition and content of monosaccharide in YCP-H

2.7 體外抗腫瘤活性篩選

利用MTT法測試YCP-H對8種腫瘤細胞株的體外抗腫瘤活性。在培養時間為96 h的條件下,不同濃度YCP-H對8種腫瘤細胞生長的抑制率影響見圖11a。由圖11a可知,YCP-H對8種腫瘤細胞的增殖抑制作用均隨著濃度的升高而增強,體現出明顯的量效關系。在1000 μg/mL的較高濃度時,YCP-H對HepG2人肝癌細胞的生長抑制率達到了94.5%,對其他腫瘤細胞的抑制率也超過了36%,顯示出一定程度的廣譜抗腫瘤效果。當濃度為0.1 μg/mL時,YCP-H僅對HCT-116人結腸癌細胞、HepG2人肝癌細胞和A-549人非小細胞肺癌細胞具有良好的體外抗腫瘤活性。以濃度對細胞的抑制率作圖可得到劑量反應曲線,從中求出YCP-H對上述3種腫瘤細胞的IC50值分別為15.1、0.08和17.1 μg/mL。對照組紫杉醇對8種腫瘤細胞生長的抑制率見圖11b,其對上述3種腫瘤細胞的IC50值分別為0.04、0.03和0.04 μg/mL。結果顯示,YCP-H對HepG2人肝癌細胞的增殖抑制活性接近紫杉醇,并且YCP-H對人結腸癌細胞HCT-116和肺癌細胞A-549的增殖也有較強的抑制作用。

圖11 不同濃度YCP-H和紫杉醇對8種腫瘤細胞生長的抑制率Fig.11 Inhibition rates against growth of 8 kinds tumor cell lines with YCP-H and taxol at different concentrations注:a. YCP-H(藥物組);b. 紫杉醇(對照組)。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken設計和響應面分析,優化得到了加壓溶劑萃取法提取板栗種仁多糖的工藝條件。當投料量為10 g,靜態提取次數為3次時,設置溫度為60 ℃、時間為9 min、壓力為6 MPa,多糖得率可高達19.78%±0.27%。高壓條件可以加速水分子對板栗種仁細胞壁的破壞作用,加快多糖釋放的同時增大多糖的溶解度,因此多糖得率較高。板栗粗多糖經純化、分級后,其高分子量組分YCP-H的重均分子量范圍為217～5900 kDa,說明加壓溶劑萃取法的提取條件相對溫和,可以有效避免高分子量多糖的降解。

YCP-H是具有β-吡喃構型的酸性多糖,由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和巖藻糖6種單糖組成,物質的量比依次為1.00∶36.06∶34.93∶15.12∶10.05∶3.16。板栗粗多糖和純化多糖由形態不規則的顆粒組成,而YCP-H中存在大量的纖維狀聚集體,推測分級前后的多糖樣品在溶液中有著不同的聚集態結構。YCP-H在較高濃度時顯示出一定程度的廣譜抗腫瘤效果,在低濃度時對A-549人非小細胞肺癌細胞、HepG2人肝癌細胞和HCT-116人結腸癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用。其中,YCP-H對HepG2人肝癌細胞的IC50值可低至0.08 μg/mL,其活性接近陽性藥紫杉醇。

本研究首次發現了燕山板栗多糖的抗腫瘤活性,為增加燕山板栗產品的附加值、延長燕山板栗食品加工的鏈條化、實現燕山板栗的高質化利用奠定了基礎。然而,板栗的品種多樣,板栗種仁多糖的結構、抗腫瘤活性與具體品種是否相關還需要進行進一步拓展研究。另一方面,多糖抗腫瘤作用的構效關系較為復雜,板栗種仁多糖的糖苷鍵連接方式、糖鏈分支度乃至聚集形態等結構特征還需要進一步解析。