肉桂精油/海藻酸鈉/膨潤土復合凝膠微球的制備及緩釋研究

侯聰穎,張詩韻,孫建安,*,王 卉(.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.海南熱帶海洋學院食品科學與工程學院,海南三亞 572022)

近年來,食源性疾病的爆發日趨嚴重,因此尋找有效無毒的抗菌劑十分重要。植物精油作為天然提取物,安全性高,抗菌性能優良,因而備受青睞[1]。其中肉桂精油具有強烈的抑菌特性,可作為天然防腐劑用于食品行業[2-3],但因其具有較強的揮發性而在一定程度上限制了其應用,若將其制成凝膠微球則可有效的控制其揮發。

海藻酸鈉是制備凝膠微球的一種常用材料,無毒,易降解,成本低,與Ca2+等二價金屬陽離子相互作用,可制得凝膠微球,被廣泛應用于藥物裝載領域[4-6]。但是海藻酸鈉制成的凝膠微球機械強度低,遇水易溶脹,突釋現象嚴重[7],為了解決這些問題,可采用不同的物理化學方法對海藻酸鈉進行改性[8-10]。在海藻酸鈉中加入低成本的無機材料是克服海藻酸鈉凝膠微球缺陷的較佳方式,膨潤土的主要成分是蒙脫石,蒙脫石具有獨特的空間結構和陽離子交換特性,且具有高的彈性模量,可以增強聚合物的機械強度和穩定性[11-12]。同時,膨潤土安全性高,對人體無害,其有效成分蒙脫石可作為藥物及藥物緩釋載體使用,例如盧建華等[13]的研究表明雙歧三聯活菌片結合蒙脫石散可以治療兒童腹瀉,提高機體免疫力。Kawase等[14]研究表明蒙脫石可以保護質粒DNA不受胃內酸性環境和腸內DNA降解酶的影響,成功將其送入到小腸細胞。例如Zhao等[15]設計了基于蒙脫石的聚合物納米顆粒,可以用來局部給藥治療青光眼,可遞送足夠濃度的藥物,且對絨毛膜尿囊膜的刺激性非常小。將其與海藻酸鈉共混改性制成的凝膠微球,機械性能更佳,能夠更好的控制藥物的釋放[15-17]。

目前,研究人員對海藻酸鈉和膨潤土共混改性主要應用于農業,工業領域,例如周紅軍等[18]將改性膨潤土和海藻酸鈉復合制作成的凝膠微球可以有效提高毒死蜱的釋放性能。Shawky[19]以蒙脫石和海藻酸鈉為材料制作而成的珠粒用來除去水溶液中的鉛,從而改善水質等。但是對于其在食品領域尤其是針對揮發性精油的緩釋控制研究較少。因此,在本研究中,將海藻酸鈉中加入膨潤土進行混合改性,包封肉桂精油,優化得到復合凝膠微球的最佳制備條件,然后在不同的條件進行肉桂精油的釋放實驗,最后用零級,一級,Higuchi,Ritger-Peppas,Noyes-Whitney以及Hixson-Crowell動力學模型對釋放曲線進行擬合[20-25],以期擴大肉桂精油在今后食品領域的應用,并提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海藻酸鈉、硝酸鉀、氯化鈣、硝酸鉀、氯化鈉、溴化鉀 均為國產分析純,國藥集團化學試劑有限公司;膨潤土 含量>80%,浙江豐虹新材料有限公司;肉桂精油 食品級,上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇 分析純,西隴科學股份有限公司。

JY99-IIDN高速分散機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HWS-26超級水浴鍋 金力永磁壇市儀器制造有限公司;LT-DBXF精密可編程熱風循環鼓風干燥箱 立德泰勀(上海)科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酸鈉/膨潤土(SA/BT)凝膠微球的制備 于55 ℃配制2%海藻酸鈉溶液,在其中加入1%(w/v)的膨潤土,8000 r/min分散5 min,超聲20 min,放置3 h使膨潤土進行充分溶脹,加入肉桂精油(與載體的比例為2∶1)以及0.2%的tween-80,再將混合液8000 r/min分散5 min,形成均勻的乳白色液體后,用注射器以距離液面30 cm的距離滴入1.5%的CaCl2溶液中,靜置45 min,用蒸餾水反復清洗3～5次,于40 ℃干燥箱中干燥5 h至重量無明顯變化。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 海藻酸鈉濃度對包封率的影響 保持膨潤土添加量1%(w/v)、肉桂精油與載體的比例為2∶1、CaCl2濃度為1.5%、tween-80濃度為0.2%,分別配制0.5%、1%、2%、3%、4%海藻酸鈉溶液,制備凝膠微球并測定其包封率。

1.2.2.2 膨潤土添加量對包封率的影響 保持海藻酸鈉的濃度為2%、肉桂精油與載體的比例為2∶1、CaCl2濃度為1.5%、tween-80濃度為0.2%,分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(w/v)膨潤土,制備凝膠微球并測定其包封率。

1.2.2.3 肉桂精油與載體的比例對包封率的影響 保持海藻酸鈉的濃度為2%、膨潤土添加量為1%、CaCl2濃度為1.5%、tween-80濃度為0.2%,保持肉桂精油與載體的比例分別為0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、3.5∶1,制備凝膠微球并測定其包封率。

1.2.2.4 CaCl2濃度對包封率的影響 保持海藻酸鈉的濃度為2%、膨潤土添加量為1%、肉桂精油與載體的比例為2∶1、tween-80濃度為0.2%,分別配制CaCl2濃度為0.5%、1.5%、2.5%、3%、3.5%,制備凝膠微球并測定其包封率。

1.2.2.5 tween-80濃度對包封率的影響 保持海藻酸鈉的濃度為2%、膨潤土添加量為1%、肉桂精油與載體的比例為2∶1、CaCl2濃度為1.5%,分別配制濃度為0.50%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的tween-80水溶液,制備凝膠微球并測定其包封率。

1.2.3 響應面試驗 根據各個因素對包封率的影響,選取海藻酸鈉濃度、肉桂精油與載體比例、膨潤土添加量三個因素進行響應面實驗,優化得到最佳的制備條件以及相應的參數及方程。用Design-Expert軟件進行試驗設計[26],因素與水平表如表1所示。

表1 試驗因素與水平表Table 1 Experimental factors and level table

1.2.4.1 測定波長的選擇 取0.5 mL肉桂精油加入到50 mL的容量瓶中并用無水乙醇定容,取該定容好的溶液0.5 mL于50 mL容量瓶并定容,再取第二次定容好的溶液1.0 mL定容至50 mL。以無水乙醇作為空白溶液對照,取最終定容好的溶液在240～350 nm下進行波長掃描,得到肉桂精油的最大吸收波長為287 nm[27-28]。

1.2.4.2 肉桂精油標準曲線的制作 分別取上述第二次定容好的溶液0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL,并在50 mL容量瓶定容,測定最大吸收波長下的吸光度值,得到肉桂精油濃度與吸光度值的關系[27-28],即標準曲線,(R2=0.999)。

1.2.4.3 肉桂精油含量及包封率的計算 凝膠微球中肉桂精油含量測定方法:稱取0.05 g凝膠微球,加入一定量的無水乙醇,研磨至完全破碎,然后超聲功率360 W條件下超聲15 min,使其完全破壁溶解。過濾,將濾液定容至50 mL,取一定量定容后的溶液稀釋至合適的倍數,在最大吸收波長下測定其吸光度,并根據標準曲線計算凝膠微球中肉桂精油含量[27-28]。并按照下式計算包封率:

1.2.5 不同溫度緩釋實驗 響應面試驗優化后得到最佳制備條件下制備海藻酸鈉/膨潤土(SA/BT)包封肉桂精油的凝膠微球,同時以單一海藻酸鈉(SA)包封肉桂精油的凝膠微球為對照比較兩者的釋放性能。分別取稱取干燥后的兩種凝膠微球0.05 g若干份置于玻璃平皿中,放置在室溫(25 ℃)和溫度分別為40、60、80 ℃的鼓風干燥箱中模擬凝膠微球在不同溫度下的釋放[29],每隔一段時間后測量凝膠微球中肉桂精油的含量,按照下式計算肉桂精油的累積釋放量,以橫坐標為釋放時間,縱坐標為累積釋放量,繪制釋放動力學曲線。

累積釋放量(%)=(1-某一測量時刻每份凝膠微球中肉桂精油含量/每份凝膠微球原始肉桂精油含量)×100

1.2.6 不同濕度緩釋實驗 配制飽和的溴化鈉(模擬相對濕度為55%環境)、氯化鈉(模擬相對濕度為75%環境)、硫酸鉀(模擬相對濕度為90%環境)放入干燥器底部,稱取0.05 g凝膠微球若干份放入玻璃平皿中,并將玻璃平皿置于干燥器中,密封[30]。每隔一段時間測定每份凝膠微球中肉桂精油的含量。計算累積釋放量,繪制釋放動力學曲線。

1.2.7 釋放模型擬合 分別用零級,一級,Higuchi,Ritger-Peppas,Noyes-Whitney以及Hixson-Crowell動力學模型進行擬合,得到擬合方程和決定系數[31-33]。

1.3 數據處理

實驗數據為三次平行實驗測定結果,采用SPSS 22軟件進行顯著性分析,采用Origin 9.1軟件擬合釋放曲線并進行分析,Origin 9.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 各因素對凝膠微球包封率的影響

2.1.1 海藻酸鈉濃度對凝膠微球包封率的影響 圖1為海藻酸鈉濃度對凝膠微球包封率的影響。當海藻酸鈉滴入Ca2+溶液中時,海藻酸鈉分子與Ca2+作用形成凝膠微球。海藻酸鈉的粘度直接決定凝膠微球的質量,海藻酸鈉的粘度隨著其濃度的增加而加大。當海藻酸鈉濃度足夠高時,生成的凝膠微球才能保持好的球形。當濃度較低時,微球受兩相接觸碰撞影響較大,會影響其質量[32]。因此海藻酸鈉濃度的選擇至關重要。由圖1可知,作為載體材料之一的海藻酸鈉,對包封率的影響較大,隨著海藻酸鈉的濃度的增加,包封率呈現先增加后減小的趨勢。當濃度達到2%時,包封率達到最高,為79.64%。原因是海藻酸鈉濃度較低時,形成的網絡結構比較松散,不穩定,導致成型效果不佳,包封率也很低。海藻酸鈉濃度過高時,形成致密堅硬的網絡結構,海藻酸鈉微球可提供給肉桂精油的空間有限,一定程度上減少了對肉桂精油的包封率。同時,海藻酸鈉各個濃度對包封率的影響差異性顯著(P<0.05)。

圖1 海藻酸鈉濃度對凝膠微球包封率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on encapsulation efficiency of gel microspheres注:不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05);圖2～圖5同。

2.1.2 膨潤土添加量對凝膠微球包封率的影響 由圖2可知,隨著膨潤土添加量的加大,包封率先增加后降低,在添加量為1.0%時達到最高,為79.64%。由于膨潤土具有吸附性較好,具有較高的彈性模量,可增強凝膠微球的機械強度和對肉桂精油的包封率[35-36]。所以隨著膨潤土添加量的增加,會增大凝膠微球的包封率,在添加量為1.0%時效果最佳。膨潤土中含有大量的羥基,可以與海藻酸鈉相互作用形成氫鍵,但是當膨潤土添加的量繼續增加時,會造成膨潤土的團聚,與海藻酸鈉氫鍵作用力的減少,使復合載體產生缺陷,導致包封率的下降[18,36]。在膨潤土的添加量為1.0%時,凝膠微球的包封率為79.64%,同時各個添加量之間的差異性顯著(P<0.05)。

圖2 膨潤土添加量對凝膠微球包封率的影響Fig.2 Effect of the addition amount of bentonite on the encapsulation efficiency of gel microspheres

2.1.3 肉桂精油與載體比例對凝膠微球包封率的影響 肉桂精油與載體的比例對微球的包封率影響如圖3所示。隨著兩者比例的增加,包封率先增加后降低,兩者比例達到2.0∶1的時候包封率達到最高。理論上,兩者比例越大,肉桂精油被包封進去的可能性就越大,所以剛開始隨著兩者比例的增加,包封率呈現上升趨勢。同時,凝膠微球顏色較透明,這是因為肉桂精油添加量較少,使得載體的顏色相對比較明顯。隨著兩者比例的增大,凝膠微球乳白色加深。當兩者的比例大于2.0∶1時,由于載體有一定的包封能力,因此增加肉桂精油量過多會使其沒有辦法全部被包封,容易造成其流出,部分沒有被包封的肉桂精油漂浮在CaCl2溶液中,造成精油浪費,包封率下降[27-28]。在兩者比例為2.0∶1時,包封率最高,為79%,且各個比例之間的差異性顯著(P<0.05)。

圖3 肉桂精油與載體的比例對凝膠微球包封率的影響Fig.3 Effect of the ratio of cinnamon oil to carrier on the encapsulation efficiency of gel microspheres

2.1.4 CaCl2濃度對凝膠微球包封率的影響 CaCl2作為凝膠微球成型的重要陽離子供體,它的濃度也會影響凝膠微球的包封率。隨著CaCl2的濃度增加,被交聯的海藻酸鈉增多,形成更多的三維網絡結構,包封率也隨之上升,在1.5%時達到最高,為79.68%,當CaCl2的濃度繼續增加,凝膠微球表面硬度增加,包封率也呈下降趨勢。其原因是當CaCl2的濃度過大時,凝膠微球的外層會首先形成致密的網狀結構,外層迅速凝固,對CaCl2進入內層有了一定的阻礙作用,不利于凝膠微球的形成,造成了包封率的降低[6],同時,不同CaCl2濃度之間的差異性顯著(P<0.05)。

圖4 CaCl2濃度對凝膠微球包封率的影響Fig.4 Effect of CaCl2 concentration on the encapsulation efficiency of gel microspheres

2.1.5 tween-80濃度對凝膠微球包封率的影響 tween-80作為乳化劑,起到乳化載體與肉桂精油的作用,由圖5可知,其對凝膠微球的包封率的影響較小,隨著tween-80濃度的增加包封率先增加后減小,在濃度為0.2%的時候微球包封率達到最高,在79.27%。乳化劑濃度較低時,乳化力不足,乳化效果和乳液穩定性不佳,精油不能完全被乳化劑分子乳化,會造成包封率的達不到最大值,但是乳化劑的過多使用也會造成包封率有一定的下降,這可能與乳化劑過多使用破壞乳液穩定性,從而導致凝膠微球包封率的下降[37-39]。同時,tween-80濃度在0.05%和0.25%差異性不顯著(P>0.05),其他濃度差異性顯著(P<0.05),說明乳化劑濃度過高或者過低均會造成凝膠微球的包封率的降低。

圖5 Tween-80濃度對包封率的影響Fig.5 Effect of tween-80 concentration on encapsulation efficiency of gel microspheres

2.2 響應面試驗

通過對表2的實驗數據進行多元化回歸方程分析,得到包封率的回歸方程為:

包封率(%)=-230.55+230.11A+65.59B+16.38C-1.65AB-0.86AC-1.63BC-55.78A2-14.51B2-4.00C2

表2 試驗設計結果Table 2 Experimental design results

表3 包封率回歸模型方差分析表Table 3 Encapsulation rate regression model analysis of variance

通過響應面試驗分析,軟件預測的最佳制備條件為海藻酸鈉濃度2.02%,肉桂精油與載體的比例2.07∶1,膨潤土的添加量1.1%,包封率為80.92%,考慮到實際實驗條件,將條件調整為海藻酸鈉濃度2%,肉桂精油與載體的比例2.1∶1,膨潤土添加量為1.1%,在此條件下驗證實驗得到的包封率為80.74%,與預測值相差較小,模型可靠。

2.3 緩釋實驗結果

2.3.1 不同溫度下的緩釋動力學曲線 圖6為25、40、60、80 ℃不同溫度下的釋放動力學曲線,以累積釋放量來表示凝膠微球的釋放效果。由圖6可知,在各個溫度下SA/BT的釋放量均低于SA一組,表示膨潤土的添加確有利于控制肉桂精油的釋放。其中,SA和SA/BT的凝膠微球在25 ℃的條件下,84 d時累積釋放量分別為31.61%和20.55%;40 ℃的條件下,78 d時累積釋放量分別為34.1%和27.84%;60 ℃的條件下,48 d時累積釋放量分別為45.83%和38.21%;80 ℃的條件下,在120 h時累積釋放量分別為56.71%和42.71%。肉桂精油通過載體材料的微孔進行擴散,且隨著溫度的增加這種擴散作用增大,因此溫度的升高,肉桂精油的揮發性增強,且其揮發釋放過程呈現前期較快,后期較慢的趨勢,在前期釋放較快的過程中,由圖6可知,SA/BT凝膠微球釋放速率低于SA凝膠微球,因此膨潤土的添加在一定程度上改善了單一的SA微球的突釋現象,減慢了肉桂精油釋放。

圖6 不同溫度釋放動力學曲線Fig.6 Release kinetics curve at different temperatures 注:a:25 ℃;b:40 ℃;c:60 ℃;d:80 ℃。

2.3.2 不同溫度下緩釋動力學模型擬合 將不同溫度下的釋放動力學曲線用零級,一級,Higuchi,Ritger-Peppas,Noyes-Whitney以及Hixson-Crowell動力學模型進行擬合后,發現Ritger-Peppas的決定系數R2的值高于其它的模型,所以Ritger-Peppas模型能更好的反應肉桂精油從凝膠微球中的釋放。表4分別代表凝膠微球SA/BT和SA凝膠微球在25、40、60、80 ℃下Ritger-Peppas模型擬合之后的方程與決定系數(R2)。如表4所示。其中,釋放機制與Ritger-Peppas釋放模型中的釋放因子n有關系,其中,在25 ℃時,SA/BT和SA凝膠微球的n值分別為0.4246,0.2844均小于0.45;40 ℃時兩者的n值分別為0.4089,0.3017;60 ℃時兩者的n值分別為0.3252,0.2983;80 ℃時兩者的n值分別為0.3107,0.2655。當n≤0.45,藥物釋放機制為Fick自由擴散;當0.45

表4 不同溫度下Ritger-Peppas釋放動力學模型擬合結果Table 4 Fitting results of Ritger-Peppas release kinetic model at different temperatures

2.3.3 不同濕度下的緩釋動力學曲線 圖7為55%、75%、90%相對濕度下的釋放動力學曲線。影響肉桂精油凝膠微球釋放的因素除了環境溫度外,環境濕度也是一個重要的因素。圖7中分別為在相對濕度為55%,75%和90%的相對濕度下SA和SA/BT凝膠微球的釋放動力學曲線。隨著相對濕度的增加,釋放速率同時呈現增加的趨勢。

圖7 不同相對濕度下釋放動力學曲線Fig.7 Release kinetics curves at different relative humidity注:a:55%;b:75%;c:90%。

其中,SA和SA/BT凝膠微球在55%的相對濕度下,84 d時的累積釋放量分別為37.71%和27.41%;在75%的相對濕度下,84 d時累積釋放量分別為52.37%和40.52%;在90%的相對濕度下,192 h(8 d)時累積釋放量分別為71.31%和45.63%。其過程均可以分為第一階段的快速釋放和第二階段的緩慢釋放,其中SA/BT凝膠微球的釋放速率明顯低于SA凝膠微球,對單一SA凝膠微球的突釋現象有一定改善作用。隨著濕度的增加,釋放速率加快,可能是由于部分親水性的聚合物溶脹導致了肉桂精油擴散距離縮短,導致其釋放速率的增加。

2.3.4 不同濕度下緩釋動力學模型擬合 同樣將不同濕度下的釋放動力學曲線用零級,一級,Higuchi,Ritger-Peppas,Noyes-Whitney以及Hixson-Crowell動力學模型進行擬合后,發現Ritger-Peppas動力學模型的決定系數R2值最高,擬合性最佳,所以Ritger-Peppas模型能更好的反應肉桂精油在不同的濕度下從凝膠微球中的釋放。表5為SA/BT凝膠微球和SA凝膠微球在相對濕度為55%,75%,90%下不同釋放動力學模型的擬合結果,擬合方程與決定系數R2如表格所示。其中,在55%相對濕度下,SA/BT和SA凝膠微球的n值分別為0.3634,0.3662;75%相對濕度下兩者的n值分別為0.4495,0.3995;90%相對濕度下兩者的n值分別為0.4365,0.4001;n值均小于0.45,說明肉桂精油的釋放以Fick自由擴散為主。

表5 55%相對濕度下不同釋放動力學模型擬合Table 5 Fitting of different release kinetic models at 55% relative humidity

3 結論

通過單因素和響應面實驗分析,得到了海藻酸鈉/膨潤土復合凝膠微球包封肉桂精油的最佳制備條件:海藻酸鈉濃度2%,肉桂精油與載體的比例2.1∶1,膨潤土添加量為1.1%,CaCl2濃度1.5%,tween-80濃度0.2%,包封率可達80.74%。同時,海藻酸鈉/膨潤土凝膠微球相對于單一海藻酸鈉包封肉桂精油后在不同的溫度和濕度條件下均能夠更好的控制肉桂精油的揮發性,使其能夠更長久的發揮作用,為肉桂精油在食品領域尤其是防腐保鮮方面的應用提供了一定的理論指導,但是需要對其應用的具體食品種類以及保鮮方式進行進一步的深入探究。