響應面法優化超聲波協同酶法提取杜仲葉多糖工藝

陳雪花,楊萬根(吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室,湖南張家界 427000)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)是一種名貴的中藥材,在我國已有2000多年的藥用歷史[1],中國古代醫學典籍中就曾記載杜仲具有補腎、補肝虛、強筋骨、降血壓等功效[2]。杜仲全身都是寶,杜仲的莖、皮在臨床上可用于治療高血壓、陽痿、腰痛以及坐骨神經痛,而杜仲葉可用于治療糖尿病或被制成增強體質、預防疾病的功能性飲料或保健食品[3-4]。長期以來人們都是以杜仲皮入藥,但因杜仲樹生長緩慢,往往需要經過多年的生長才能取皮入藥,故在市場上杜仲皮供不應求[5]。研究證實,杜仲葉和杜仲皮的化學成分基本一致,富含綠原酸、黃酮類化合物、桃葉珊瑚甙、環烯醚萜及多糖等活性成分,功效基本相同,可以以葉代皮入藥[6-7]。2018年4月,國家衛生健康委員會公布 “關于征求將黨參等9種物質作為按照傳統既是食品又是中藥材物質管理意見的函(國衛辦食品函〔2018〕278號)”,杜仲葉作為9種物質之一被列入其中。“藥食同源”給了杜仲葉一個新身份,在此背景下杜仲葉相關保健產品的市場需求將持續增大。

多糖有廣泛的藥理活性,在抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、免疫調節[10]等方面有獨特的功效,并且基本對機體無毒害作用,而受到研究者越來越多的關注。熱水萃取是傳統的多糖提取方法,但其存在能耗高、效率低、環境污染嚴重等問題[11],因此相關學者一直在研究多糖的高效提取方法,出現了諸如超聲波輔助提取[12]、微波輔助提取[13]、酶法輔助提取[14]、超高壓輔助提取[15]、亞臨界提取[16]等新方法。關于杜仲多糖的提取已有較多的文獻報道,如孫曦曉等[17]以杜仲樹皮為原料,采用超聲輔助法提取杜仲多糖,多糖得率為1.94%。劉曉河等[18]研究了果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶對杜仲多糖提取率的影響,發現三種酶均能提高多糖提取率,其中以果膠酶提高多糖提取率效果最為顯著。但是這些報道均集中于杜仲多糖單一輔助提取技術研究,多糖得率不高。

目前國內外還未見將超聲波和酶法輔助同時應用于杜仲葉多糖提取的文獻報道,因此本文采用Plackett-Burman設計和響應面法對超聲波-協同酶法提取杜仲葉多糖的工藝進行研究。先通過單因素實驗考察復合酶添加量、pH等因素對多糖得率的影響,再通過Plackett-Burman實驗確定影響顯著因素,并對這些影響顯著因素進行最陡爬坡實驗以逼近各因素的最大響應區域,最后采用Box-Behnken實驗優化提取工藝。本研究將為杜仲葉多糖的高效提取技術提供參考,對以杜仲葉多糖為主要原料的保健食品、藥品的開發和杜仲產業的經濟效益的提高都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉(2019年10月采摘于吉首大學林產化工湖南省重點實驗室杜仲基地),洗凈后于60 ℃鼓風干燥箱中烘干,然后粉碎成粉末,過60目篩備用;木瓜蛋白酶(1×106U/g)、纖維素酶(5×105U/g)、果膠酶(5×105U/g) 浙江東進生物科技有限公司;葡萄糖、乙酸、乙酸鈉、苯酚、濃硫酸、石油醚(60～90 ℃沸程)、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、活性炭 國藥集團化學試劑有限公司;所有有機溶劑 均為國產分析純。

TF-650CT型多用途恒溫超聲波提取機 上海拓紛機械設備有限公司;RE-501A型真空旋轉蒸發器 鄭州特爾儀器設備有限公司;GZX-9246MBE型數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;PHSJ-4A型實驗室pH計 上海雷磁精科有限公司;TG165型臺式高速離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;JA2003型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉粉的預處理 取杜仲葉粉于60 ℃鼓風干燥箱中干燥至恒重,用5倍體積的石油醚(W/V)于80 ℃恒溫水浴浸提2 h除去杜仲膠和脂類,重復3次,過濾、晾干。濾渣再用5倍體積的80%乙醇(w/V)于80 ℃恒溫水浴浸提取2 h除去小分子單糖、雙糖、寡糖等物質,重復3次,過濾、晾干,置于干燥器中備用。

1.2.2 杜仲葉多糖提取 精確稱取2.0 g預處理后的杜仲葉干粉,以蒸餾水為提取溶劑,按照工藝研究中的不同參數設定超聲波協同酶法提取條件進行多糖的提取。提取結束后,4000 r/min離心10 min,上清液即為多糖提取液。多糖提取液于-0.09 MPa、60 ℃條件下真空減壓濃縮至原體積的十分之一,室溫條件下往濃縮液中加入95%乙醇至溶液乙醇濃度達80%,4 ℃靜置12 h后,4000 r/min離心10 min,棄去上清液,將得到的沉淀用無水乙醇洗2次,晾干后即得到杜仲葉粗多糖。用蒸餾水將多糖充分溶解并定容至1000 mL,測多糖含量,計算多糖得率。

1.2.3 杜仲葉多糖含量的測定及多糖得率計算 用苯酚-硫酸法[19]測多糖含量。葡萄糖標準曲線繪制:取葡萄糖于105 ℃干燥至恒重,精確稱取20 mg,加蒸餾水溶解,定容至500 mL。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的葡萄糖標準液,置于10 mL試管中,各加蒸餾水補足至2 mL,加入6%苯酚1 mL搖勻,迅速滴加濃硫酸5 mL,搖勻,室溫放置5 min,置沸水浴中加熱20 min,迅速冷卻至室溫,于490 nm處測吸光度A。以蒸餾水為空白,標準葡萄糖質量濃度C(mg/mL)為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線,得出回歸方程:A=0.0108C-0.0114,R2=0.9991。精密吸取1.0 mL定容后的杜仲葉多糖液樣品,加蒸餾水補足至2 mL,測吸光度A。以蒸餾水為空白,重復測定三次,取平均值。按下式計算杜仲葉多糖得率(Y):

式中:C為待測樣品液中的多糖質量濃度(mg/mL);V為待測樣品液的體積(mL);n為樣品液的稀釋倍數;m為杜仲葉粉的質量(g)。

1.2.4 單因素實驗 精確稱取2.0 g預處理后的杜仲葉粉,預設4%復合酶(木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶1∶1[20])添加量,pH4.0,提取溫度50 ℃,超聲波功率100 W,液料比 20∶1 mL/g,提取時間20 min為單因素實驗中的常規量。以復合酶添加量(3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%)、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、提取溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)、超聲波功率(40、60、80、100、120、140 W)、液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)、提取時間(5、10、15、20、25、30 min)6個因素變量替換實驗中的常規量。按1.2.2與1.2.3中的方法提取、測定并計算多糖得率,每組重復三次。

1.2.5 Plackett-Burman實驗 以單因素實驗為基礎,利用Plackett-Burman實驗篩選出顯著影響杜仲葉多糖得率的關鍵因素。每個因素取高(+1)和低(-1)兩個水平,共12組實驗。實驗因素與水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment

1.2.6 最陡爬坡實驗 根據Plackett-Burman實驗得到的一次擬合方程,設計各關鍵因素的爬坡方向和步長。通過最陡爬坡實驗使關鍵因素的取值逼近最大響應區域,確定響應面實驗的0水平,以便建立有效的響應面擬合方程[21]。

1.2.7 響應面優化實驗 根據Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗結果,對篩選出的復合酶添加量、pH和超聲波功率3個關鍵因素進行三因素三水平的Box-Behnken實驗(見表2)。對Box-Behnken實驗結果建立數學回歸模型并分析。

表2 Box-Behnken實驗因素與編碼水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3 數據統計

所有實驗都進行3次重復操作,運用minitab 17軟件設計Plackett-Burman實驗,Design-Expert.8.0.6軟件設計Box-Behnken實驗,SPSS 23和Origin 9.0軟件進行ANOVA分析和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 復合酶添加量對杜仲葉多糖得率的影響 復合酶添加量對杜仲葉多糖得率的影響見圖1。當復合酶的添加量從3.0%增加到4.0%時,杜仲葉多糖得率快速提高,在4.0%達到最大值4.09%±0.02%,但當添加量大于4.0%時,得率呈緩慢下降趨勢。這可能是因為隨著酶的量增加,酶與底物的接觸機會增大,加速了細胞壁的溶解,有利于多糖的溶出[22]。但是,過高的酶添加量會造成蛋白酶自溶和其他兩種酶的水解,從而使底物的水解速度下降。因此,確定4.0%作為復合酶的最佳添加量。

圖1 復合酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Effects of multienzyme complex dose on the yield of polysaccharide

2.1.2 pH對杜仲葉多糖得率的影響 pH對杜仲葉多糖得率的影響見圖2。隨著pH的增大,杜仲葉多糖得率先快速上升,然后急速下降,在pH為4.0時達到最大值4.21%±0.04%。pH能改變酶的構象和影響酶的生物活性[23],不同種類的酶有各自最適作用pH,但在復合使用時,各類酶對某一特定底物的綜合作用效果最大時為該復合酶的最佳pH。圖2顯示,pH4.0是復合酶的最佳pH。此外,有研究顯示酶輔助提取法對果膠酶有很大的依賴性,而果膠酶的最適作用pH為4.0[24]。故確定pH4.0作為最適pH。

圖2 pH對多糖得率的影響Fig.2 Effects of pH on the yield of polysaccharide

2.1.3 提取溫度對杜仲葉多糖得率的影響 提取溫度對杜仲葉多糖得率的影響見圖3。當提取溫度從35 ℃升高到45 ℃時,杜仲葉多糖的得率迅速提高,然后隨著溫度的進一步升高而降低,在45 ℃時達到最大值4.37%±0.03%。溫度的升高會提高酶的活性和分子運動,加速細胞內多糖的釋放和溶劑的進入[25],但溫度過高則會使酶變性,酶活降低[26],從而導致多糖得率下降。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.1.4 超聲波功率對杜仲葉多糖得率的影響 超聲波功率對杜仲葉多糖得率的影響見圖4。多糖得率隨著超聲波功率的增大先緩慢上升然后下降,在100 W時達到最大值4.49%±0.02%。這是因為超聲波產生的空洞效應和振動可以促進細胞破碎,有利于多糖的溶解和擴散,但是過高的功率可能會導致多糖降解[27]。因此,100 W被選為最佳超聲波功率。

圖4 超聲波功率對多糖得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

2.1.5 液料比對杜仲葉多糖得率的影響 液料比對杜仲葉多糖得率的影響見圖5。隨著液料比的增加,杜仲葉多糖的得率增加,在20∶1 mL/g時達到最大值4.60%±0.03%。這是因為較大的液料比可以提高溶劑在細胞中的擴散速率,并從材料中溶解更多的多糖[28-29]。而當液料比大于20∶1 mL/g時多糖得率反而下降,這可能是因為酶與底物接觸機會降低,細胞壁降解減慢所致?？紤]到提取效率和后繼濃縮的成本,液料比選擇20∶1 mL/g為宜。

圖5 液料比對多糖得率的影響Fig.5 Effects of ratio of liquid to solid on the yield of polysaccharide

2.1.6 提取時間對杜仲葉多糖得率的影響 提取時間對杜仲葉多糖得率的影響見圖6。杜仲葉多糖的得率隨著提取時間的延長而上升,在15 min達到最大值4.72%±0.03%,超過15 min得率下降。溶劑的滲入以及多糖的溶出都需要一定時間,但提取時間過長可能會導致多糖遭到超聲波的破壞,影響多糖得率[30]。因此選擇最佳提取時間為15 min。

圖6 提取時間對多糖得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on the yield of polysaccharide

2.2 Plackett-Burman實驗結果

Plackett-Burman實驗結果及各因素的效應評價如表3、表4所示。

表3 Plackett-Burman實驗結果Table 3 Results of Plackett-Burman experiment

由表4可知,影響多糖得率的顯著因素為復合酶添加量、pH和超聲波功率,根據其P值大小可知重要性依次為:pH(B)>超聲波功率(D)>復合酶添加量(A),其中pH對杜仲葉多糖得率的影響達到極顯著水平(P<0.01)。提取溫度、液料比和提取時間為非顯著影響因素,故選擇pH、超聲波功率和復合酶添加量開展下一步的響應面優化實驗?？紤]到提取效率與節約成本,在響應面優化實驗中將提取溫度、液料比和提取時間分別固定為45 ℃、20∶1 mL/g和15 min。

表4 Plackett-Burman實驗各因素效應評價Table 4 Effect evaluation of factors of Plackett-Burman experiment

2.3 最陡爬坡實驗結果

對表3中的數據進行回歸分析,得到一次擬合方程:Y=0.031042+0.001258A-0.002508B+0.000792C-0.001475D+0.000825E+0.000425F。根據該擬合方程中各因素的系數設計最陡爬坡實驗的方向,系數如果為正值,爬坡實驗中各因素水平值為由小變大,反之,則由大變小。步長根據單因素實驗結果進行設計。表5為最陡爬坡實驗設計與結果。結果表明表5中第4號實驗的多糖得率最大,故選擇第4號實驗中的實驗條件作為后面Box-Behnken實驗的0水平。

表5 最陡爬坡實驗結果Table 5 Results of steepest climb experiment

2.4 Box-Behnken響應面實驗結果

Box-Behnken響應面實驗結果見表6。

表6 Box-Behnken響應面實驗結果Table 6 Results of Box-Behnken experiment

對實驗結果進行回歸擬合,得到顯著影響杜仲葉多糖得率(Y)因素的二元回歸方程:

Y=-0.6+0.58475A+0.054625B+0.75475C+4.125×10-3AB-1.70553×10-6AC+4.125×10-3BC-0.122A2-4.3625×10-4B2-0.157C2

表7 回歸模型方差分析結果Table 7 Results of variance analysis of response surface quadratic model

將一個因素固定在0水平,其余兩因素間交互作用對多糖得率影響的響應面圖見圖7。圖7(A)和圖7(C)的響應面坡度較陡,說明pH與超聲波功率、超聲波功率與復合酶添加量間交互作用顯著,而圖7(B)的響應面坡度較前面兩個小,即pH與復合酶添加量間交互作用不顯著。

圖7 兩因素間交互作用響應面圖Fig.7 Response surface plots of interaction between two factors

3 結論

本實驗對超聲波-協同酶法提取杜仲葉多糖工藝條件進行優化,通過Plackett-Burman實驗篩選出三個顯著影響多糖得率的因素:pH、超聲波功率和復合酶添加量,其重要性依次為:pH>超聲波功率>復合酶添加量。超聲波-協同酶法提取杜仲葉多糖的最佳工藝條件為復合酶添加量3.7%、pH4.0、超聲波功率100 W、提取溫度45 ℃、液料比20∶1 mL/g和提取時間15 min,在此條件下杜仲葉多糖的實際得率為4.79%±0.02%,與理論得率4.87%接近,且得率遠高于傳統的水浸提法。研究結果表明,與傳統提取方法相比,超聲波-協同酶法輔助提取法能高效提取杜仲葉多糖,有利于降低生產成本,對杜仲葉多糖的工業化生產具有重要意義。但是,超聲波物理場作用下的生產規模如何放大、如何通過酶的篩選進一步提高提取效率等問題還有待進一步的研究。