鳳岡綠茶中原花青素的提取工藝優化

盧利平,張 利,李 鈾,*,金偉嘉,丁功濤,高丹丹,陳士恩(.西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030;.西北民族大學生物醫學研究中心中國馬來西亞國家聯合實驗室,甘肅蘭州 730030)

原花青素(Procyanidins,PC)主要是由不同數目的兒茶素及其衍生物等縮合而成的多酚化合物,亦是一種生物類黃酮混合物,紅棕色粉末狀,氣味微苦澀,能溶于水和大多數有機溶劑[1]。原花青素具有抗氧化活性[2]、抗腫瘤[3]、抗輻射[4]、防治心血管疾病[5]等多種功能,在藥品、食品、化妝品等領域應用比較廣泛[6-7]。原花青素的提取方法有多種,最常用的方法有溶劑萃取法[8]、酶法提取法[9-11]、超聲波輔助提取法[12-13]、高效液相色譜法[14]、低濃度香草醛-鹽酸法[15]、紫外分光光度法、鐵鹽催化法等[16]。

目前國內外的研究者大多是針對茄子[8]、葡萄[17-18]、黑果枸杞[19-20]、山楂[21-22]、香蕉[23]等植物中的原花青素進行研究,對茶中原花青素的研究還相對較少[24-25],關于鳳岡綠茶中原花青素提取與檢測未見報道,由此可見,對武陵山片區茶葉中原花青素的測定與分析很有必要,可以增加片區茶葉的附加值和山區茶農的經濟來源,為進一步開發利用茶葉和脫貧攻堅工作起到一定推動作用。趙春艷等[26]實驗結果表明超聲輔助法優于溶劑提取法。因此,本課題以鳳岡綠茶為原料,在低濃度香草醛—鹽酸法[15]基礎上,考察乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比等因素對原花青素得率的影響,響應面優化超聲波輔助提取原花青素的工藝條件,得出最佳提取工藝,為鳳岡綠茶中原花青素的進一步綜合開發與利用提供有利的科學支撐,為進一步開發鳳岡綠茶的產品附加值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳳岡綠茶 貴州省鳳岡縣婁山春茶葉專業合作社;蒸餾水、甲醇、無水乙醇、香草醛、濃鹽酸、石油醚(均為分析純) 蘭州市奧科生物技術有限公司;原花青素標準品 Sigma公司。

KQ2200DE超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;H1650-W離心機 湘儀離心機儀器有限公司;Dor Yang DA型電子分析天平 渡揚精密儀器(上海)有限公司;BWS-0505型恒溫水槽水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;WJX-200型高速多功能粉碎機 上海緣沃工貿有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳳岡綠茶原花青素提取工藝流程 鳳岡綠茶→粉碎(過80目篩)→超聲提取→離心→原花青素提取液

1.2.2 茶樣品溶液前處理 稱取一定質量的鳳岡綠茶,用粉碎機粉碎(過80目篩),置于比色管中,按一定料液比加入一定體積分數的乙醇,蓋好蓋子,在超聲頻率40 kHz,一定溫度條件下,提取一定時間。提取結束后,過濾收集上清液,提取兩次后合并上清液并在12000 r/min離心10 min,取上清液定容至50 mL,作為提取液。

1.2.3 原花青素含量的測定 原花青素含量的測定采用改良的濃鹽酸-香草醛法[15],分別配制1%香草醛-甲醇溶液及1 mol/L鹽酸-甲醇溶液,按照體積比1∶1充分混勻得到反應工作液。

1.2.3.1 原花青素標準曲線的繪制 準確稱取原花青素標準品25 mg,置于25 mL具塞試管中,加入甲醇混合均勻后定容至刻度線,得到1 mg/mL的原花青素標準品儲備液。準確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的上述標準溶液,置于10 mL具塞試管中,加入3 mL反應工作液,甲醇定容至刻度,混勻后放入30 ℃恒溫水浴鍋中,避光反應1 h,取出靜置至室溫,甲醇調零作為空白對照,于500 nm波長處測定其吸光度(A500)值[27]。

1.2.3.2 樣品中原花青素含量的測定 準確移取1 mL樣品提取液于10 mL具塞試管中,加入3 mL反應工作液,甲醇定容至刻度,混勻后按照上述方法進行反應,反應結束后在波長500 nm處測定其吸光(A500)值,根據標準曲線計算鳳崗綠茶中原花青素濃度,并計算原花青素的得率[20]。

式中:C表示測得的原花青素濃度,mg/mL;V表示茶樣品定容體積,mL;f表示稀釋倍數;m表示茶樣品質量,g。

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 乙醇濃度對原花青素得率的影響 在控制料液比為1∶20 g/mL,超聲溫度為70 ℃、超聲時間為50 min,乙醇濃度(乙醇與水的混合溶液)分別為70%、75%、80%、85%、90%、95%的條件下,考察乙醇濃度對鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.4.2 超聲溫度對原花青素得率的影響 在料液比為1∶20 g/mL,乙醇濃度為85%,超聲時間為50 min,超聲溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃的條件下,考察超聲溫度對鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.4.3 超聲時間對原花青素得率的影響 在料液比為1∶20 g/mL,乙醇濃度為85%,超聲溫度分別為50 ℃,浸提時間分別為30、40、50、60、70、80 min的條件下,考察超聲時間對鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.4.4 料液比對原花青素得率的影響 在乙醇濃度為85%,超聲溫度分別為50 ℃,浸提時間為40 min,料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL的條件下,考察料液比對鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.5 響應面優化試驗 根據Box-Behnken設計原理,在單因素試驗的基礎上,工藝優化選取對鳳岡綠茶原花青素得率有顯著影響的乙醇濃度(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)、料液比(D)4個因素作為自變量,以鳳岡綠茶原花青素得率為響應值,進行四因素三水平的響應面分析實驗,優化原花青素的提取工藝,試驗因素和水平設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 數據處理

每組實驗做3次平行,結果取平均值;采用Office Excel 2003軟件進行數據分析;采用Origin 8.0制圖;Design-Expert 8.06軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與討論

2.1 原花青素標準曲線的繪制

以原花青素標準品濃度為橫坐標(X),吸光度(A500)值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,如圖1所示。求得標準曲線方程為:Y=1.615X-0.0014,相關系數R2=0.9991,且在0.1～0.6 mg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 The standard curve of proanthocyanins

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對原花青素得率的影響 由圖2可知,隨乙醇濃度的提高,總原花青素得率呈現先升高后下降趨勢,當乙醇濃度為85%時,原花青素得率最高;乙醇濃度大于85%時,原花青素得率開始下降。這是由于不同濃度的乙醇具有不同的極性,對原花青素的溶出量有一定的影響,這與原花青素本身的極性相關。同時,隨著乙醇濃度增大,脂溶性成分溶出,同原花青素形成競爭關系,導致原花青素得率下降[23]。根據單因素實驗結果及曲線變化規律,在Box-Behnken中心組實驗設計中,乙醇濃度選取80%～90%。

圖2 乙醇濃度對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanins

2.2.2 超聲溫度對原花青素得率的影響 由圖3可知,在超聲溫度20～50 ℃范圍內,原花青素得率隨著超聲溫度的升高而增大,溫度繼續升高超過50 ℃后,鳳岡綠茶原花青素得率呈下降趨勢。這是因為適當的高溫能夠促進原花青素的溶出,但是溫度過高使原花青素的結構被破壞,同時也會增加其他雜質的溶出量,因而原花青素的得率會降低[27]。根據單因素實驗結果及曲線變化規律,在Box-Behnken中心組實驗設計中,超聲溫度選取50～70 ℃。

圖3 超聲溫度對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of proanthocyanins

2.2.3 超聲時間對原花青素得率的影響 由圖4可知,鳳岡綠茶原花青素得率呈先增加后減少的變化趨勢。在30～40 min范圍內,隨著超聲時間的延長,原花青素得率不斷上升;當超聲時間為40 min時,原花青素得率達到最大值;超過40 min后,原花青素得率隨時間延長開始逐漸下降。這是由于時間過短,原花青素提取不夠充分,時間過長導致原花青素酚羥基機構破壞,影響得率[28]。為了提高原花青素得率,根據單因素實驗結果及曲線變化規律,在Box-Behnken中心組實驗設計中,超聲時間選取30～50 min。

圖4 超聲時間對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of proanthocyanins

2.2.4 料液比對原花青素得率的影響 由圖5可知,鳳岡綠茶中原花青素得率隨著料液比的增加而升高,當料液比超過1∶30 g/mL后,原花青素得率變化較小。這是由于當浸提溶劑量比較小時,鳳岡綠茶中原花青素溶出不徹底;隨著溶劑量增加,原花青素得率先增大后基本趨于平衡狀態,根據單因素實驗結果及曲線變化規律,在Box-Behnken中心組實驗設計中,料液比選取1∶30～1∶40 g/mL范圍。

圖5 料液比對原花青素得率的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the yield of proanthocyanins

2.3 響應面設計結果與分析

2.3.1 響應面法優化原花青素提取工藝 根據單因素實驗結果,通過Design-Expert 8.06軟件設計,以乙醇濃度(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)、料液比(D)為自變量,以鳳岡綠茶中原花青素得率為響應值,根據四因素三水平的中心組合實驗設計29個試驗點進行響應面分析,其中5、8、10、11、12是中心試驗,其余為析因試驗。響應面試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面設計方案及結果 Table 2 Scheme and results of response surface design

2.3.2 模型的建立與顯著性分析 通過Design-Expert 8.06軟件進行多元回歸分析,得到鳳岡綠茶提取液的乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比四因子數學回歸方程為:

Y=4.73-0.36A-0.15B-0.024C-0.004D-0.042AB-0.018AC+0.15AD+0.025BC-0.035BD-0.037CD-0.56A2-0.32B2-0.16C2-0.073D2。

表3 回歸方程方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

綜上所述,此模型可以用來分析和預測鳳岡綠茶中原花青素得率的真實情況。由F值可知,各因素對原花青素得率的影響次序為A>B>C>D,即乙醇濃度>超聲溫度>超聲時間>料液比。

2.3.3 響應面交互作用分析 響應面曲面圖可以直觀反映乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間和料液比對原花青素得率的影響,如圖6～圖11所示。對比圖6～圖11,乙醇濃度對原花青素得率的影響最大,其次是超聲溫度、超聲時間,料液比響應面相對平緩,說明其對原花青素得率的影響最小。交互效應強弱程度可以從投影面的等高線形狀中觀察,圓形為交互作用不顯著,橢圓則為交互作用顯著[28]。從圖8a中可以看出,曲面傾斜度比較大,而且越是靠近曲面頂端,顏色越深,表示乙醇濃度與料液比的交互作用顯著,其余各因素等高線橢圓形狀不明顯(圖6～圖7、圖9～圖11),表明其交互作用不顯著,這與回歸方程的方差分析結果一致。

圖6 乙醇濃度與超聲溫度對原花青素得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots of ultrasonic temperature and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

圖7 乙醇濃度與超聲時間對原花青素得率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots of ultrasonic time and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

圖8 乙醇濃度與料液比對原花青素得率影響的響應面圖Fig.8 Response surface plots of material-liquid ratio and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

圖9 超聲時間與超聲溫度對原花青素得率影響的響應面圖Fig.9 Response surface plots of ultrasonic time and temperature on the proanthocyanin extraction rate

圖10 超聲溫度與料液比對原花青素得率影響的響應面圖Fig.10 Response surface plots of ultrasonic temperature and material-liquid ratio on the proanthocyanin extraction rate

圖11 超聲時間與料液比對原花青素得率影響的響應面圖Fig.11 Response surface plots of ultrasonic time and material-liquid ratio on the proanthocyanin extraction rate

2.3.4 最佳提取工藝條件及驗證試驗 對回歸方程進行求解,即得率達到最大值時的提取條件為:乙醇濃度83.2%,提取溫度58.1 ℃,提取時間 39.7 min,料液比 1∶33.25 g/mL,在此條件下,原花青素得率為4.804%。根據實際情況,對工藝條件進行調整,調整后的最佳提取條件為:乙醇濃度83%,提取溫度58 ℃,提取時間40 min。料液比1∶33 g/mL;為進一步確定響應面法優化結果的準確性,在調整后的工藝條件下做3次重復試驗驗證,得到鳳岡綠茶中原花青素得率為4.798%±0.05%。結果表明,經過回歸方程擬合出的理論值與實際值的RSD值為1.05%,說明用響應面法優化鳳岡綠茶原花青素的提取工藝條件具有可行性。

3 結論

采用響應面分析法對鳳岡綠茶中原花青素進行超聲輔助提取工藝優化,擬合了乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間和料液比四個因素對鳳岡綠茶中原花青素得率影響的回歸模型,分析結果得到四因素對原花青素得率的影響大小次序為:乙醇濃度>超聲溫度>超聲時間>料液比。優化后的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度83%,提取溫度58 ℃,提取時間40 min。料液比1∶33 g/mL。在此條件下,鳳岡綠茶中原花青素得率為4.798%±0.05%,高于黑果枸杞中原花青素得率[20],與預測值(4.804%)相近,且其相對誤差為1.05%,說明響應面優化后的工藝條件可行。采用超聲輔助提取鳳岡綠茶中原花青素,操作簡單,得率高,為鳳岡綠茶中原花青素的進一步開發利用提供依據。