超高效液相色譜串聯質譜法同時測定減肥類保健食品中10種非法添加利尿類及瀉下類藥物

李 卓,陳玉龍，孫 曉,饒雅琨,董曼曼,王蓓蓓,賈寒冰,王 濤,梁紅月，張亞鋒(.西安市食品藥品檢驗所,陜西西安 70054；.陜西省藥品技術審查查驗中心，陜西西安 70065)

隨著人們生活水平的提高,對美麗、健康等方面有了更多的要求,眾多減肥類保健食品產品應運而生。然而許多不法分子在這些利益驅使下,追求短暫減肥效果和高額利潤,在保健品中非法添加利尿類和下瀉類藥物,這些藥物作為處方藥有嚴格的服用劑量要求,患者在不知情的情況下長期服用這些產品時,可能會因為攝入過量引起嚴重的不良反應,與有些藥物同服還會發生藥物相互作用,導致難以預測的嚴重后果,使得廣大消費者在身體上受到不同程度的傷害。

隨著高精密儀器的發展,現已出現了許多針對違法添加藥物的分析方法[1],有薄層色譜法[2]、高效液相色譜法[3-6]、超高效液相色譜-串聯質譜法[7-16]、超高效液相色譜-靜電場軌道肼質譜[17-18]、超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜法[19-21]等。顯而易見,液質已成為了違法添加藥物檢測的主流方法。目前國內外有關保健食品的違法添加藥物測定報道較多,但尚無針對減肥類保健食品同時測定10種非法添加藥物(氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達帕胺、酚酞、蘆薈大黃素、比沙可啶、大黃酚、大黃素)的液質方法。本實驗擬采用甲醇提取,電噴霧電離源,建立多種減肥類非法添加藥物的超高效液相色譜-三重四級桿質譜(UPLC-MS/MS)測定方法,以便市場監管部門在此類監測檢查中能發現更多的非法添加物,為廣大群眾的身體健康做出更安全的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯噻嗪(CAS號:58-94-6,純度100%)、氫氯噻嗪(CAS號:58-93-5,純度99.7%)、氯噻酮(CAS號:66258-76-2,純度99.5%)、甲氯噻嗪(CAS號:135-07-9,純度99.6%)、吲達帕胺(CAS號:26807-65-8,純度97.7%)、酚酞(CAS號:77-09-8,純度100%)、蘆薈大黃素(CAS號:481-72-1,純度98.3%)、比沙可啶(CAS號:603-50-9,純度100%)、大黃酚(CAS號:481-74-3,純度99.2%)、大黃素(CAS號:518-82-1,純度98.7%) 中國食品藥品檢定研究院;樣品采集13批減肥類保健食品 均抽自百貨商店、藥店;甲醇、乙腈 色譜純,Fisher;甲酸 質譜級,aladin。

Ulimate3000-TSQ Quantiva超高液相色譜-質譜聯用儀 配有Trace Finder數據處理系統，美國賽默飛科技有限公司;KQ-700VDB雙頻數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司;Milli-Q Integral 5 制水機 美國Millipore公司;ME204E 萬分之一電子天平、MS105十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;臺式離心機 美國Sigma。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液制備 分別精密稱取10種藥物標準品各10 mg于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成1 mg/mL單一成分標準儲備液,于4 ℃避光保存3個月。

分別取上述配制好的單一標準品儲備液各0.5 mL,置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成10 μg/mL的混合標準品溶液,備用。取混合標準溶液適量,用甲醇配制系列濃度的混合標準溶液。

1.2.2 樣品溶液制備 精密稱取0.5 g樣品(顆粒劑、片劑取適量研細;膠囊劑取內容物適量研細;口服液充分搖勻、軟膠囊取適量內容物混勻;蜜餞取可食部分研細)于25 mL量瓶中,加甲醇適量,渦旋振蕩,超聲(頻率80 kHz;功率700 W)處理30 min,放冷至室溫,加甲醇定容至刻度,搖勻,6000 r/min離心5 min,取上清液1 mL,用甲醇稀釋10倍,用0.22 μm有機系微孔濾膜濾過,待測。

1.2.3 色譜-質譜條件 色譜條件:Thermo Hypersil GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱溫30 ℃;流速0.2 mL/min;進樣體積2 μL;流動相為水(A)-乙腈(B),梯度程序洗脫為0～5 min,15% B;5～12 min,15%～60% B;12～15 min,60% B;15～17 min,60%～90% B;17～20 min,90% B;20～21 min,90%～15% B;21～25 min,15% B。

質譜條件:采用多反應檢測(MRM);霧化氣N2;碰撞氣Ar;霧化溫度300 ℃;離子傳輸管溫度350 ℃;毛細管電壓3.5 kV;鞘氣流速4.57 L/min;輔助氣流速11.36 L/min。各目標化合物監測離子對及相關參數設定見表1。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

采用針泵流動注射連續進樣的方式進行質譜全掃描檢測,分別在正、負離子模式下考察了10種目標藥物的一級質譜響應,發現氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達帕胺、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素的[M-H]-峰響應強度大且穩定,酚酞、比沙可啶的[M+H]+峰響應強度大且穩定,故選擇正負離子分段掃描模式進行檢測。然后給予母離子不同的碰撞能量進行二級質譜掃描,對子離子進行優化,每個化合物選擇2個響應值高且穩定的子離子,最終在優化條件下確定響應較強的離子作為定量離子,另一離子作為定性離子,結果詳見表1。

表1 10種化合物的保留時間及質譜參數Table 1 Retention time and spectrometric parameters of 10 compounds

2.2 色譜條件的優化

比較了水-甲醇、水-乙腈、0.01%甲酸水-乙腈三種體系的流動相,結果發現在水-甲醇體系中無論是以80∶20為初始流動相,還是以90∶10為初始流動相,由于溶劑效應的影響,氯噻嗪和氫氯噻嗪均為分叉峰,且都無法達到保留時間分離。在0.01%甲酸水-乙腈體系中,氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達帕胺、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素的峰響應強度有不同程度減弱。在水-乙腈體系中,10個目標化合物均有良好的峰形,且通過調節梯度洗脫程序使質荷比在3個道爾頓以內的氯噻嗪和氫氯噻嗪、蘆薈大黃素和大黃素均可達到保留時間分離,從而保證了10種目標物的準確測定。提取離子流圖見圖1。

圖1 10種化合物的多反應監測色譜圖(100 ng/mL)Fig.1 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatogram of the 10 compounds(100 ng/mL)

2.3 基質效應考察及消除

保健食品基質比較復雜,常常會干擾目標物的檢測,會對檢測結果的準確性產生影響。因此,在建立液質檢測方法時應對基質效應進行評價,并采取消除措施,以保證結果的準確、可靠。

基質效應[22-24]是指基質成分和目標化合物在進行離子化時相互競爭而導致目標化合物信號強度有不同程度的增強或減弱的現象,包括基質增強效應和基質抑制效應。實驗選用了陰性液體基質和陰性固體基質樣品,各采用未用甲醇10倍稀釋的空白樣品溶液(BL1、BS1)、空白樣品溶液(BL2、BS2)、甲醇10倍稀釋空白樣品溶液(BL3、BS3)加入10種藥物混合標準溶液,配制成各3種混合標準基質溶液,再用甲醇(A)配制同一濃度水平的混合標準溶液,通過 MS/MS分析測定,按照式(1)計算MEx:

式(1)

式中:MEx表示基質效應的大小,大于100%為基質增強效應,小于100%為基質抑制效應。A、Bx分別為待測標物在純溶劑和在不同樣品溶液中的峰面積。

由表2可知,在BL1溶液中,氯噻嗪、氫氯噻嗪、大黃素有不同程度的基質減弱效應,其中氯噻嗪、氫氯噻嗪基質減弱較強,比沙可啶有一定程度的基質增強效應。

表2 10種化合物在不同稀釋體積基質溶液中的基質效應Table 2 Matrix effects(ME)of the 10 compounds in different diluent

而在BL2和BL3溶液中,各化合物ME值在98.1%～108.7%之間,可忽略基質效應。在BS1溶液中,氯噻嗪、氫氯噻嗪、甲氯噻嗪、吲達帕胺、酚酞、蘆薈大黃素、比沙可啶、大黃素、大黃酚均有大幅度的基質減弱效應,氯噻酮有較弱的基質減弱,可忽略基質效應。而在BS2和BS3溶液中,各化合物ME值在82.4%～106.4%之間,可忽略基質效應。故為消除基質效應帶來的定量影響,最終選擇樣品在甲醇超聲提取定容后,用甲醇十倍稀釋后上機為本實驗在前處理方法。

2.4 線性關系考察

取“1.2.1”項下系列濃度的混合標準溶液,按“1.2.3”項下色譜條件進行測定,以質量濃度(ng/mL)為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,10種藥物的回歸方程及線性范圍,見表3。

2.5 檢測限和定量限

精密稱取空白樣品1份,加入混合標準溶液適量,按照“1.2.2”項下同法處理樣品,按“1.2.3”項下色譜-質譜條件進行測定,以3倍信噪比(S/N)時為方法的檢出下限;以10倍信噪比(S/N)時為方法的定量下限,結果見表3。

表3 10種藥物的線性范圍、相關系數及方法檢出限、定量限Table 3 Limits of detection,limits of quantitative,linear range,regression equation and correlation coefficient of 10 drugs

2.6 儀器精密度試驗

精密吸取混合標準溶液2 μL,連續進樣6次,記錄峰面積,計算氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達帕胺、酚酞、蘆薈大黃素、比沙可啶、大黃酚、大黃素的峰面積的RSD(n=6)分別為0.69%、0.57%、0.84%、2.00%、2.21%、2.98%、2.52%、1.25%、1.28%、1.79%均符合要求。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取固體制劑和液體制劑空白樣品各9份,加入混合標準溶液適量,并用氮氣吹干,制成高、中、低三濃度三平行的加標回收樣品,然后按照“1.2.2”項下同法處理該18份樣品。按“1.2.3”項下檢測條件進行測定,計算各組分的回收率和RSD,結果見表4。結果表明無論在固體基質還是液體基質中,10種化學成分的平均回收率均在70%～125%之間,回收率良好。

表4 10種藥物回收率(n=3)Table 4 Recoveries of 10 drugs(n=3)

2.8 重復性試驗

精密稱取固體制劑和液體制劑陰性樣品各6份(n=6),加入適量混合標準溶液,分別按“2.1.2”項下方法制備 6 份樣品溶液,按“1.2.3”項下色譜-質譜條件進行測定,通過標準曲線分別計算含量,結果10中目標化合物的RSD在0.16%～8.28%,重復性較好。

2.9 穩定性試驗

精密稱取空白樣品1份,加入混合標準溶液適量,按照“1.2.2”項下方法制備樣品溶液,分別保存0、2、4、8、12、24、48 h測定10種藥物的含量見圖2。結果發現,氯噻酮在8 h內穩定性良好,含量變化小于4.36%,待12 h后含量變化大于10%,酚酞、甲氯噻嗪在12 h穩定性良好,含量變化小于5.93%,其余8種藥物在24 h內的穩定性良好,含量變化小于6.64%。

圖2 48 h內10種藥物的含量Fig.2 Content of the 10 durgs within 48 h

2.10 樣品測定

取13批保健食品,按照“1.2.2”項下方法制備樣品溶液,分別按“1.2.3”項下色譜-質譜條件進樣測定,如果樣品中的質量色譜峰保留時間與標準工作液中的某種組分一致(變化范圍在±2.5%之內);試樣中定性離子對的相對豐度與濃度相當混合標準工作液的相對豐度一致,相對豐度偏差不超過最大允許偏差[15]規定的范圍,則可判定為試樣中存在該組分。結果3批檢出非法添加酚酞(含量分別為534、1880、127 μg/kg)、2批檢出非法添加氫氯噻嗪(含量分別為1284、462 μg/kg),陽性率為38%,其中有碧生源牌常菁茶和纖纖梅兩個樣品中檢出少量蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素,由于產品原料中含有決明子,還需根據配料進一步計算以確定其是否為非法添加還是帶入。某陽性樣品的總離子流圖和提取離子流圖詳見圖3、圖4。

圖3 樣品A的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of sample A

圖4 樣品A的提取離子流圖(酚酞)Fig.4 Extracted ion chromatogram(phenolphthalein)of sample A

3 結論

本文建立了一種減肥類保健食品中10種非法添加利尿類及瀉下類藥物的超高效液相-串聯質譜測定方法。該方法靈敏度高,專屬性好,較好地降低了基質效應帶來的定量影響,適用于減肥類保健食品的非法添加藥物的測定,為市場監管部門在此類監測檢查中能發現更多的非法添加物提供參考。