一種新型過氧化氫傳感器的構建及其在牛奶中的應用

徐軍軍,吳甜甜,席慧婷,葉璀珠,鄧丹雯,黃贛輝(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

過氧化氫(H2O2)作為防腐劑在食品加工和環境分析中具有重要的意義[1]。研究表明,過量的過氧化氫會影響牛奶中酪蛋白和血清蛋白的質量,從而降低原料奶的營養價值;除此之外過氧化氫具有致癌、加速細胞衰老等毒副作用,損害消費者的經濟利益和健康[2]。因此,很多國家明確規定禁止在乳制品中添加過氧化氫。現有的過氧化氫檢測技術主要包括分光光度法[3]、化學發光法[4]、電化學發光法[5]、色譜法[6]等,但這些方法存在靈敏度低、操作復雜、儀器昂貴等缺點。電化學傳感器技術由于其具有選擇性好、靈敏度高、制備工藝簡單、檢測時間短等優點而被廣泛應用于臨床和食品檢測中[7]。研究已報道Hb/PdNPs/GR-CS/GCE[8]、Hb/sol-gel/CPE[9]、Hb-collagen-CNTs[10]被構建成電化學生物傳感器用于檢測過氧化氫,表現出良好的檢測限和靈敏性。但這些傳感器是將功能性材料滴涂在電極表面,修飾材料易脫落而降低傳感器的穩定性。因此研制出一種新型具有高靈敏性、穩定性的過氧化氫傳感器具有重要的應用價值。

血紅蛋白(Hb)對過氧化氫具有良好的催化活性,可作為辣根過氧化物酶在H2O2生物傳感器中的理想替代品[11-12]。然而,血紅蛋白的氧化還原活性中心位于蛋白質的深層結構,這意味著血紅蛋白與電極表面間的電子傳遞效率低[11]。因此,選擇一種具有良好生物相容性的功能材料固載血紅蛋白以保持其生物活性,促進其活性中心與電極之間的電子轉移是非常必要的。金屬納米粒子及其氧化物因其比表面積大、生物相容性好、吸附能力強而受到廣泛關注[13-15]。納米鎳[16]、納米銀[17]及其氧化物、ZnO[18]等貴金屬常被用于構筑電化學傳感器的材料用于食品和臨床檢測;其中,金納米顆粒具有良好的導電性和生物相容性,可以促進Hb電活性中心與電極間的直接電子轉移[19]。同時,聚吡咯(Ppy)是一種獨特的導電聚合物,具有良好的導電性、穩定性和生物相容性,是固定化酶或蛋白質的優良材料底物,廣泛用于修飾材料以提高電化學生物傳感器的導電性[20]。

本文在以聚吡咯膜為基底的玻碳電極上沉積納米金顆粒并吸附血紅蛋白制備Hb/AuNPs/GCE傳感器,開發一種新型過氧化氫電化學傳感器,研究該傳感器的靈敏性、選擇性和穩定性,并將其用于檢測牛奶中過氧化氫的檢測,為傳感器的實際生產應用提供更多的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀 天津大茂試劑有限公司;硫酸 天津致遠化學試劑有限公司;氯化鉀、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、過氧化氫(w/v=30%)汕頭西隆化工有限公司;氯金酸、吡咯、抗壞血酸、多巴胺、尿酸和L-半胱氨酸 阿拉丁試劑有限公司;牛血紅蛋白(99%) Salebo有限公司;牛奶 陽光乳業有限公司提供;電極 上海仙人儀器有限公司。

S-3400N場發射掃描電鏡 日本電子股份有限公司；Agilent5500原子力顯微鏡 美國Agilent technologies；ESCALAB250 X射線光電子能譜 美國Thermo Fisher Scientific;石英晶體微天平(CHI440) 上海辰華儀器有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 修飾電極的制備 參考Chen 等[21]的方法對裸玻電極進行預處理。以經預處理的玻碳電極為工作電極,鉑(Pt)電極為輔助電極、飽和甘汞電極(HgCl2)為參比電極構成三電極體系。配制0.1 mol/L KCl溶液,在10 mL KCl溶液中添加1 mL 新蒸吡咯,首先,將三電極體系垂直放置在含0.2 mol/L的吡咯單體的0.1 mol/L KCl溶液為支持電解液中,充氮驅氧10 min。運用恒電位法聚合吡咯,恒電位法采用多電位階躍中的單一電位,設定聚合電位為0.8 V,初始電位根據開路電位方法設置為0.25 V,間隔時間為0.002 s,控制聚合電量手動終止。將得到的電極記為Ppy/GCE電極置于含1 mL HAuCl4的0.1 mol/L KNO3,設置循環伏安電位窗口為-0.2～1.0 V,掃描速度為10 mV/s,掃描圈數為5,使納米金顆粒沉積在修飾電極上,得到的修飾電極記為AuNPs/Ppy/GCE。用超純水洗凈后垂直放置于含10 mg/mL牛血紅蛋白的磷酸緩沖溶液中浸泡2 h,利用靜電吸附作用力和Au-SH共價鍵作用使血紅蛋白固載在納米金顆粒上,得到的電極記為Hb-AuNPs/Ppy/GCE。

1.2.2 Hb/NPs/Ppy/GCE制備條件優化 本文研究吡咯聚合電量、磷酸緩沖液pH、支持電解質pH、差分脈沖伏安法脈沖周期對Hb/AuNPs/Ppy/GCE響應電流的影響。

1.2.2.1 脈沖周期優化 選定吡咯聚合電量1.0×10-3、磷酸緩沖溶液pH7.0、支持電解質pH7.0時,脈沖周期分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5,以差分脈沖伏安法響應電流為評價指標,研究脈沖周期對傳感器檢測效果的影響。

1.2.2.2 吡咯聚合電量優化 選定磷酸緩沖液pH7.0、支持電解質pH7.0、脈沖周期0.3,吡咯聚合電量分別為1.0×10-3、1.5×10-3、2.0×10-3、2.5×10-3、3.0×10-3、3.5×10-3C,以差分脈沖伏安法的響應電流為評價指標,研究吡咯聚合電量對傳感器檢測效果的影響。

1.2.2.3 磷酸緩沖溶液pH優化 選定吡咯聚合電量1.0×10-3、支持電解質pH7.0、脈沖周期0.3時,磷酸緩沖溶液pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,以差分脈沖伏安法的響應電流為評價指標,研究磷酸緩沖溶液pH對傳感器檢測效果的影響。

1.2.2.4 支持電解質pH優化 選定吡咯聚合電量1.0×10-3、磷酸緩沖液pH7.0、脈沖周期0.3,支持電解質pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,以差分脈沖伏安法的響應電流為評價指標,研究支持電解質溶液pH對傳感器檢測效果的影響。

1.2.3 Hb/AuNPs/Ppy/GCE修飾電極的物理表征

1.2.3.1 SEM表征 在上述最優條件下制備修飾電極,將樣品在37 ℃烘箱中干燥1 h,將干燥的電極頭固定在樣品臺上,利用環境掃描電鏡在低中空模式下進行掃描,選擇執行電壓15.0 kV,放大倍數為50.0 K觀察修飾電極的微觀結構。

1.2.3.2 AFM表征 在上述最優條件下制備修飾電極,將樣品在37 ℃烘箱中干燥1 h。將干燥的電極頭固定在樣品臺上,采用原子力顯微鏡在真空下對樣品進行觀測,探針共振為330 kHz,固定力大小為48 N/m,速率為0.6 Hz,測試溫度為25 ℃。

1.2.3.3 XPS表征 在上述最優條件下制備修飾電極,將樣品在37 ℃烘箱中干燥1 h。將干燥的電極頭固定在樣品臺上,利用ESCALAB 250型X射線能譜儀在真空條件下對修飾電極的組成元素進行分析,可以準確的判斷各材料是否成功的修飾到電極表面。

1.2.4 Hb/AuNPs/Ppy/GCE修飾電極的電化學表征

1.2.5 過氧化氫檢測方法 以玻碳電極為基底的修飾電極為工作電極、鉑電極為輔助電極,飽和甘汞電極作為參比電極構成三電極體系。差分脈沖伏安法(DPV)的檢測電位窗口為-0.8～0 V,支持電解質為0.1 mol/L KCl溶液。評價指標為DPV方法的響應電流。

1.2.6 樣品處理及檢測 參考Karimi等[22]的牛奶預處理方法,將20 mL 1 mol/L H2SO4與80 mL牛奶混合,離心(20 min,8000 rad/s),收集上清液,用1 mol/L NaOH調整溶液pH為7.0,得到牛奶標準溶液。在牛奶標準樣液中分別添加10、20、50、100 μmol/L H2O2,根據差分脈沖伏安法所得到的響應電流計算該傳感器在牛奶樣品中檢測過氧化氫的加標回收率。

1.3 數據處理

以上實驗均平行三次,從CHI440C石英晶體微天平中將原始數據導出到Excel,經分列等處理后,導入到Origin 8.0專業作圖軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 修飾電極的物理表征

2.1.1 SEM表征 如圖1A1所示,Ppy/GCE表面呈現凸起的海島狀結構,這表明聚吡咯膜修飾成功,該結構能夠增膜的比表面積,從而固載更多的納米金顆粒。較Ppy/GCE而言,AuNPs/Ppy/GCE修飾電極的表面形貌發生了明顯的變化,一層球狀顆粒均勻的分布在聚吡咯膜上(圖1A2)。X射線能譜對AuNPs/Ppy/GCE修飾電極的組成元素進行表征,如圖1A3所示,其主要組成元素為C和Au,其中C元素可能來源于聚吡咯膜或者GCE,而Au元素只可能來自金,表明金顆粒成功地修飾到電極表面。

2.1.2 AFM表征 圖1B展示了各修飾電極的AFM形貌,圖1B1也展示了Ppy/GCE修飾電極海島狀結構,與SEM表征結果一致,聚吡咯膜的厚度約為11 nm,海島狀的結構極大的增加其比表面積,這為固載納米金顆粒提供更多的結合位點。圖1B2表面均勻地分布著30 nm左右的球狀顆粒,可能是納米金顆粒。Hb/AuNPs/Ppy/GCE表面密集的分布著直徑約為15 nm左右顆粒,極有可能為血紅蛋白(圖1B3)。

2.1.3 XPS表征 XPS用來表征各電極修飾材料的組成元素,結果如圖1C所示,Ppy的組成元素為C、N、O(圖1C1),其中C既可能來自于聚吡咯膜,也可能來自于玻碳電極中的C。AuNPs/Ppy的組成元素為Au、C、O,而且Au所占的比例很大(圖1C2)表明納米金顆粒成功到沉積到電極表面,同時也驗證了SEM和AFM表征圖中均勻分布的粒徑約為30 nm的球狀顆粒為納米金粒子。Hb/AuNPs/Ppy的XPS譜圖中Au所占的比例大幅度減少,相反,O和N的比例均增加,同時Fe元素出現在能譜圖中,這些事實表明血紅蛋白成功的吸附在納米金顆粒上。

圖1 各修飾電極的物理表征Fig.1 Physical characterization of modified electrode注:A為修飾電極的SEM圖(A1:Ppy/GCE,A2:AuNPs/Ppy/GCE,A3:能譜圖);B為AFM圖(B1:Ppy/GCE,B2:AuNPs/Ppy/GCE,B3:AuNPs/Ppy/GCE);C為XPS圖(C1:Ppy/GCE,C2:AuNPs/Ppy/GCE,C3:AuNPs/Ppy/GCE)。

2.2 修飾電極的電化學表征

2.2.3 傳感器催化能力測試 圖2C展示了各修飾電極在含有1 mmol/L H2O2的KCl溶液中的循環伏安曲線,GCE在-0.8V左右出現一個小而寬的還原峰,表明玻碳電極在通電條件下能夠使過氧化氫分解(曲線4),AuNPs/Ppy/GCE的還原峰響應電流增加,表明聚吡咯和納米金顆粒對過氧化氫具有一定的催化能力。曲線1展示了Hb/AuNPs/Ppy/GCE的循環伏安曲線,還原峰響應電流顯著增加,約為裸玻碳電極的6.2倍,表明血紅蛋白對過氧化氫具有良好的催化效果。與此同時,循環伏安法被用來研究Hb/AuNPs/Ppy/GCE修飾電極在添加H2O2前后的KCl溶液的電化學行為。如圖2D所示,在不含過氧化氫條件下,較小的氧化峰和還原峰出現在分別約為-0.42和-0.48 V(曲線a),這是典型的血紅蛋白氧化還原峰[23]。當在支持電解質中添加1 mmol/L H2O2后,陽極峰消失,陰極峰電流顯著增加(曲線b),這是因為血紅蛋白催化過氧化氫還原促使H2O2的還原峰顯著增加,其機理可以概括為血紅蛋白中的Hb-Fe2+被過氧化氫氧化轉化為Hb-Fe3+,又迅速在電極表面被還原成Hb-Fe2+[24-25]。

圖2 各修飾電極的電化學表征Fig.2 electrochemical characterization of each modified electrode注:A為各修飾電極在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L 溶液中的循環伏安曲線,B為各修飾電極的EIS圖,C為各修飾滴電極在含有1 mmol/L H2O2的KCl溶液中的循環伏安曲線。D為Hb/AuNPs/Ppy/GCE在含有或不含H2O2的KCl溶液中的循環伏安曲線。(a為不含H2O2,b為含H2O2)。

2.3 傳感器參數優化

2.3.1 脈沖周期的選擇 不同脈沖周期對Hb/AuNPs/Ppy/GCE傳感器的電流響應圖如圖3A所示,傳感器的響應電流值隨脈沖周期的增加先變大后減小,在差分脈沖伏安法的脈沖周期為0.2 s時,傳感器的響應電流值最大,因此,本實驗的差分脈沖伏安的脈沖周期選定為0.2 s。

2.3.2 吡咯聚合電量的選擇 吡咯聚合電量與形成的聚吡咯膜具有一定的關系,當聚合電量低時表面粗糙度低,當聚合電量高時Ppy呈現三維增長,導致薄膜表面粗糙度增加[26]。由圖3B可知,聚合電量在1.0×10-3～3.5×10-3C范圍內,差分脈沖伏安法響應電流逐漸增大,表明修飾電極的導電性隨著沉積電荷的增加而增加,因為當聚合電量變大時,聚吡咯逐漸生長,厚度增加,增加其導電性。當聚合電量達3.0×10-3C,修飾電極的相應電流減小,這是因為聚吡咯薄膜在較高電流密度下非常粗糙和脆弱,導致電流響應下降。因此選擇吡咯聚合電量為3.0×10-3C。

2.3.3 PBS溶液pH選擇 如圖3C所示,當磷酸緩沖溶液的pH為6.5時,差分脈沖伏安法的響應電流最強,可能因為血紅蛋白的等電點為7.1,此時帶正電荷的血紅蛋白與帶負電荷的納米金顆粒通過相互靜電作用最強,納米金顆粒上吸附的血紅蛋白更多,導致響應電流更大,當pH超過6.5時,血紅蛋白與納米金之間的吸附作用下降,導致催化能力下降[27]。因此選擇磷酸緩沖液的pH為6.5。

2.3.4 KCl溶液pH 如圖3D所示,Hb/AuNPs/Ppy/GCE在pH為7.0的支持電解質中催化H2O2還原的差分脈沖伏安法的響應電流最大。因此選擇支持電解質的pH為7.0。在上述最優條件下制備修飾電極。

圖3 傳感器的參數優化Fig.3 The effects of the different factor注：A:脈沖周期;B:吡咯聚合電量;C:PBS緩沖液的pH;D:KCl溶液的pH。

2.4 標準曲線與檢出限

H2O2濃度對Hb/AuNPs/Ppy/GCE生物傳感器電流響應的影響如圖4A所示,當支持電解質中的H2O2濃度成梯度增加時,還原峰的響應電流值呈線性增加。響應電流值與H2O2濃度的線性關系如圖4B所示,兩者間的線性方程為I(μA)=9.25924+0.00995C(μmol/L),其中線性相關系數R2為0.99567。根據國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)推薦方法[21]計算得出Hb/AuNPs/Ppy/GCE生物傳感器對過氧化氫的檢出限為0.2 μmol/L,并且該傳感器的檢測時間低至12 s,可以滿足實際樣品的在線檢測。

圖4 不同H2O2含量與響應電流的差分伏安曲線圖(A)及H2O2含量與響應電流的線性關系圖(B)Fig.4 Different H2O2 content and response current differential volt-ampere curve diogram(A)and H2O2concent and response current linear relationship diagram(B)

2.5 抗干擾實驗

Hb/AuNPs/Ppy/GCE生物傳感器對過氧化氫、抗壞血酸、多巴胺、等物質的抗干擾性研究如圖4B所示,I-t圖直觀的描繪了該傳感器在添加入一定量抗干擾物質的電流變化曲線圖。50 s時,在支持電解質中加入20 μmol/L H2O2,電流驟然增加,這是因為過氧化氫將血紅蛋白中的Fe2+氧化為Fe3+,氧化還原過程中產生的電子在電極表面傳遞,導致電流增加。分別在100、150、200、250 s時加入200 μmol/L抗壞血酸、多巴胺等物質,響應電流沒有明顯變化,當在300 s時再次加入過氧化氫時,響應電流再次驟然增加,表明該傳感器對抗壞血酸、多巴胺、等物質具有良好的抗干擾性,為用于實際樣品中的過氧化氫檢測奠定理論基礎。

圖5 Hb-AuNPs/Ppy/GCE在添加20 μmol/L H2O2和200 μmol/L AC、DA、UC、L-Cys時的計時電流響應Fig.5 Amperometric i-t response of Hb-AuNPs/Ppy/GCE for adding 20 μmol/L H2O2and 200 μmol/L ascorbic acid(AC),dopamine(DA),uric acid(UC),L-cysteine(L-Cys)into the slightly stirred 0.1 mol/L KCl solution respectively

2.6 穩定性實驗

生物傳感器在含有20 μmol/L H2O2的KCl中差分脈沖伏安法重復測定5次。結果如圖6所示,差分脈沖伏安法的響應電流在9.5×10-6A附近,5次平行實驗的響應電流的相對標準偏差為3.2%,間接表明過氧化氫與血紅蛋白間的氧化還原反應是可逆的。

圖6 Hb/AuNPs/Ppy/GCE修飾電極在含20 μmol/L H2O20.1 mol/L KCl溶液中測定5次的差分脈沖伏安響應電流Fig.6 DPV response current of Hb/AuNPs/Ppy/GCE measured 5 times in 0.1 mol/L KCl with 20 μmol/L H2O2

2.7 實際樣品檢測

將Hb/AuNPs/Ppy/GCE生物傳感器用于牛奶中過氧化氫檢測,結果如圖表1所示,該傳感器的回收率在92.7%～116.0%之間,平均標準差為3.8%,表明我們所構建的傳感器可以用于實際樣品中過氧化氫的檢測。

表1 傳感器在牛奶樣品中的過氧化氫回收率Table 1 The recovery rates of hydrogen peroxide in milk

3 結論與討論

本實驗成功構建一種新型的H2O2生物傳感器,以聚吡咯膜為基底沉積納米金顆粒,并利用靜電作用將血紅蛋白分子吸附在金粒子上構建Hb/AuNPs/Ppy/GCE修飾電極。我們提出的生物傳感器具有良好的敏感性、選擇性和穩定性,AuNPs和Hb對H2O2具有良好的協同催化作用。將構建的傳感器用于牛奶樣品中的過氧化氫檢測,其回收率為92.7%～116.0%之間,并且檢測時間低至12 s,可以用于實際樣品中過氧化氫殘留量的在線檢測。

本研究利用電化學修飾材料的特異性檢測,初步構建了可用于過氧化氫檢測的Hb/AuNPs/Ppy/GCE傳感器,并對該傳感器的檢測方法進行優化,但是要將這種方法投入到實踐中還需進行深入的研究:如該傳感器的儲存時間及更廣范圍內的應用,本課題組將針對這兩個問題做進一步研究。