基于主成分分析微波提取圓頭蒿多糖工藝中單糖組分變化

郭淑娟,朱晟永,賈 悅,李 敏,王露露,李 麗,王俊龍,2,趙 瀟,2,*(.西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心,甘肅蘭州 730070)

近年來,天然多糖被公認為天然免疫調節劑,具有抗腫瘤[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]等免疫調節功能[4],具有很高的利用價值,被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等領域[5]。圓頭蒿(ArtemisiasphaerocephalaKrasch)作為一種菊科植物,廣泛分布于我國西北部和蒙古國的荒漠地帶[6]。其種籽富含植物油脂和多糖,具有潛在的生物質能源價值[7-8]。因此,從圓頭蒿種籽中高效提取圓頭蒿多糖(ASP),研究提取工藝對ASP單糖組分的影響,對于進一步充分利用天然生物資源具有一定的意義。

在眾多的多糖提取過程中[9],微波輔助提取法是常用且高效的提取方法[10-15],在電磁場的作用下能夠有效分離多糖中的主要組分,并且具有加熱充分、減少溶劑用量、易于控制等優點[16]。然而,微波提取工藝條件對多糖的單糖組分有著不可忽略的影響,例如微波提取短時間內對細胞膜破碎作用較大,可能會降低了某些反應的活化能,或使多糖內部自身的化學鍵斷裂,發生裂解,生成小的分子片段降低分子質量等一系列不定因素[17]。其次,單糖組成及含量的變化將直接影響多糖發揮生物活性,Ferreiraa等[18]在研究中報導,不同的單糖組成和糖鏈連接方式直接影響了多糖的免疫調節活性。最近研究也表明含有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的多糖更能有效刺激正常脾淋巴細胞增殖增強免疫活性[19]。因此有必要對微波提取工藝中對單糖組分含量的影響因素進行分析研究,為進一步探究多糖的構效關系提供基礎。

主成分分析(Principal component analysis,PCA)[20-21]是一種標準的數據分析方法,被廣泛應用于很多科學領域,如生物統計學、神經系統科學和化學數據分析等。該方法通過少數的結果因子描述各因素之間的相互關系以及內部框架,并且計算出的新指標要盡可能不相關并全面的反應原始變量的信息,便于在研究復雜問題時能夠抓住主要的信息,從而更容易掌握主要原因,更容易清楚的了解事物的內部聯系[22-23]。本文利用SPSS軟件[24]中的主成分分析法對不同微波提取工藝得到ASP的六種單糖進行降維分析,利用提取出的主成分將六種單糖分類,最后通過成分得分矩陣的數據比較成分得分系數分析出不同條件下主要變化的單糖。此外,利用統計學的方法,不僅能夠有效對實驗數據中微波提取三變量的影響權重進行分析,而且對圓頭蒿多糖中的重要單糖組分進行分析得出結論,為進一步的開發利用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圓頭蒿膠 上海鼎芬化學科技有限公司;95%乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、苯酚(分析純重蒸餾試劑)、三氟乙酸(TFA,4 mol/L)、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、無水硫酸鈉、氯仿 分析純(≥98%),單糖標品(L-鼠李糖、D-來蘇糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖) 色譜純(≥99%),晶純生化科技股份有限公司。

BL320H型電子天平 島津公司;SB-35型旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社;TSQ-8000氣相-質譜聯用儀 賽默飛世爾科技公司;集熱式磁力攪拌器 常州申光儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海愛朗儀器有限公司;DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 河南天帝電子科技有限公司;UV751GD紫外/可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;TGL-16B高速臺式離心機 北京松源華興科技發展有限公司;MG08S-2B微波實驗儀 南京江研微波系統工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 圓頭蒿多糖提取 稱取一定量的市售圓頭蒿膠粉,按照1∶300 g/mL的料液比與去離子水混合。再按照實驗設計的微波提取時間(5、15、30、60、90、120 min)、微波提取功率(100、300、500、700、850 W)和提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)等條件進行微波輔助浸提(其中固定因素為60 min、600 W和60 ℃)。提取完畢待冷卻后抽濾棄去殘渣,濾液以4000 r/min離心10 min,將上清液旋轉蒸發濃縮到原體積的1/5,加入95%的乙醇,終體積為80%,靜置后將多糖沉淀,然后再次4000 r/min離心10 min,棄去上清液,向離心管內加入少許蒸餾水,用玻璃棒攪拌使之溶解后倒入培養皿中,再加入95%的乙醇沉淀,冷凍干燥,得到圓頭蒿多糖(ASP)[25]。

1.2.2 GC-MS單糖組成分析方法 前期研究結果表明[25],ASP由L-阿拉伯糖、D-木糖、D-來蘇糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖六種單糖組成,摩爾比為1∶4.98∶1.69∶27.86∶3.76∶13.92,其中甘露糖和半乳糖為主要單糖組成成分。GC-MS單糖組成分析方法參照實驗室先前研究[25-26]。

1.2.2.1 樣品水解 10 mg的ASP樣品(精密天平稱量)放入20 mL反應瓶中,加入5 mL三氟乙酸(TFA,4 mol/L),120 ℃下氮氣保護水解8 h,加壓至0.8 MPa蒸干TFA。

1.2.2.2 水解產物的衍生化 水解后的樣品加入10 mg鹽酸羥胺和2 mL吡啶,90 ℃下反應30 min,冷卻后加入2 mL乙酸酐,90 ℃下乙?；磻?0 min,減壓蒸干,加少量氯仿溶解,進行GC-MS分析。

1.2.2.3 單糖組成的GC-MS分析 氣相色譜條件:柱子:HP-5MS(30 m×0.32 mm×0.20 μm);進樣口溫度:250 ℃;進樣量:3 μL;氣體:He;流速:1.0 mL/min。質譜條件:掃描范圍:35～600 u;EI離子源;離子源溫度:250 ℃;四級桿溫度:160 ℃。得到的圖譜使用NIST譜庫進行檢索。將樣品與標準單糖的色譜峰保留值進行對照以確定樣品中單糖的種類,采用色譜峰面積歸一化法測定樣品中單糖的摩爾比例。

1.3 數據處理

數據標準化,運用SPSS分析中的主成分分析時,需要將所得數據進行標準化處理,解決不同量綱之間的單位問題。數據經過整理后,利用SPSS 19.0進行描述統計操作,將數據標準化后進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 單糖組成及其含量分析

本研究利用GC-MS聯用技術檢測ASP中單糖組分的乙?；a物含量,以此來測定ASP在不同微波提取條件下樣品單糖組成的變化,來初步探討微波提取對單糖組成的影響及多糖內主要單糖的變化趨勢。其次,使用主成分分析法基于不同微波提取條件(時間、功率和溫度),對ASP中的單糖組分進行研究,并通過SPSS軟件進行數據處理及分析。

2.1.1 不同微波提取時間條件下ASP中單糖組分分析 微波提取時間直接影響著反應基質中極性分子在磁場內快速、定向的排列,以及極性分子之間產生撕裂和相互摩擦的程度[27]。圖1展示了在不同時間梯度下經微波處理的ASP樣品中6種單糖組分含量的變化。

圖1 微波提取時間對ASP各單糖組分含量的影響Fig.1 Influence of microwave extraction time on the monosaccharide composition content of ASP注:A:來蘇糖;B:阿拉伯糖;C:木糖;D:甘露糖;E:葡萄糖;F:半乳糖；圖3、圖5同。

由圖1可以看出,改變微波提取時間,圓頭蒿多糖的單糖組分含量均發生了不同程度的變化。其中來蘇糖的含量變化較復雜,這可能是由于來蘇糖作為含量較少的極性分子,更容易在微波熱效應下產生高速振動,致使不穩定的熱點產生從而導致其單糖組分含量變化復雜[28]。此外,阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的含量呈現出規律性的變化:單糖組分含量在30 min前呈現增加趨勢,隨著微波提取時間繼續延長單糖組分含量明顯下降,這是因為在短時間范圍內微波提取時間越長,微波作用越充分,植物細胞壁破裂導致多糖溶出越充分,但到達一定時間后樣品中水分被蒸干,因此時間繼續延長單糖組分出現下降的趨勢[29-30]。衛強等[31]在紫荊花多糖的微波提取工藝優化研究中發現,在4～24 min的微波提取過程中紫荊花多糖的提取量與時間存在明顯的正相關趨勢。王一峰等[32]在微波提取工楤木根皮多糖的研究中同樣也證明了在微波提取40 min內楤木根皮多糖的提取率明顯上升,隨著輻照時間的延長多糖提取率明顯下降。

Gharibzahedi等[33]在研究中也報道了類似的結果,其研究表明在超聲波-微波輔助提取無花果多糖的過程中各單糖組分在0～60 min范圍內出現先增加后降低的變化趨勢。因此,可以推斷出在短時間范圍內微波提取對ASP單糖組分含量的影響呈現增加趨勢,并且在600 W,60 ℃的提取條件下ASP的最適提取時間在30～60 min之間。

主成分表達式:

F1=-0.24X1-0.08X2+0.219X3+0.249X4+0.257X5+0.197X5

式(1)

F2=-0.188X1+0.489X2-0.271X3-0.222X4+0.151X5+0.347X6

式(2)

根據表1中可知,在不同時間條件下微波提取的ASP中,六種單糖提取出的主要成分有兩個,第一主成分特征值=3.633>1,貢獻率為60.549%,第二主成分的特征根=1.852>1,貢獻率為30.886%,兩個主成分的累計貢獻率到達91.415%,即兩個主成分解釋了不同時間條件下六種單糖變化程度的91.415%,結果說明提取出兩個主成分是全面的。李莎等[34]、宋瑞琦等[35]和Aksic等[36]分別在關于單糖組成主成分分析的研究中利用主成分特征值解釋了單糖組分變化程度,證實了提取出主成分的全面性。

表1 解釋的總方差Table 1 Total variance of interpretation

表2和圖2表示了提取出的主成分與原始數據之間的相關程度,即提取出的主成分含有原始變量的數據[37]。根據文獻所報道,在九香蟲及相似品的多糖組成分析研究中,通過成分得分矩陣和主成分分析圖清晰反映出不同單糖組分之間的差異性,以及單糖組分的變化關系[34]。從表2中可以看出,第一主成分與甘露糖、半乳糖和葡萄糖的相關系數都接近1>0.85,說明較全面的包括了這三種單糖的變化信息,而阿拉伯糖的信息涵蓋較差。第二主成分中阿拉伯糖的相關系數接近1,說明涵蓋阿拉伯糖信息,而其他五種單糖的相關系數較低,對第二主成分的解釋程度較差。因此在不同微波提取時間下提取的ASP中,來蘇糖、木糖、甘露糖和半乳糖的變化程度比阿拉伯糖的變化幅度大。Cheng等[38]也報導了類似的結論,通過主成分分析法明確闡述了在決明子多糖提取過程中,微波提取時間對甘露糖和半乳糖的組分含量影響較大。因此,通過該分析方法能夠清晰的反映在不同微波提取時間條件下微波輔助提取的ASP中主要單糖組分的含量變化明顯。

表2 成分得分矩陣及成分得分系數矩陣Table 2 Component score matrix and component score coefficient matrix

圖2 不同微波提取時間條件下ASP中單糖主成分荷載圖Fig.2 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different microwave extraction time

2.1.2 不同微波提取功率條件下ASP中單糖組分分析 微波提取法主要利用微波能量穿透進入基質內部,然而影響微波能量大小的關鍵因素來源于微波功率的大小[16]。因此該部分主要討論不同微波提取功率對單糖組分的影響。圖3顯示了不同提取功率處理下ASP樣品中的6種單糖的含量變化趨勢,且總體變化規律與不同微波提取時間條件下保持一致。研究發現不同點在于含量較低的來蘇糖組分變化規律異于其他單糖組分,其在850 W功率時含量下降,推測這是由于來蘇糖分子,在高功率的微波提取下高速振動產生過高的熱量,其分子結構遭到破壞致使其單糖組分含量呈現下降趨勢[27]。因此可以得出結論在60 min,60 ℃的提取條件下ASP的最適提取功率為400～600 W。

圖3 微波提取功率對ASP各單糖組分含量的影響Fig.3 Influence of microwave extraction power on the monosaccharide composition content of ASP

根據表3可知,與2.2.1不同的是,在不同微波提取功率條件下處理的ASP中提取出了三個主要成分并且累計貢獻率到達97.542%,即從三個主成分全面解釋了不同功率條件下六種單糖變化程度的97.542%。其次,根據表4和圖4主要反映出第一主成分與甘露糖和葡萄糖的相關系數都接近1>0.85,說明較全面的包括了這兩種單糖的變化信息,其中半乳糖的信息涵蓋較差。然而,第二主成分中半乳糖的相關系數接近1,說明涵蓋半乳糖信息,而其他五種單糖的相關系數較低,對第二主成分的解釋程度較差。此外,單糖組分總體變化規律與2.2.1相同,不同之處在于低含量的木糖組分變化幅度減小,因此可以推斷出改變微波提取功率對含量較高的主要單糖組分影響較大。譚等[39]在對人生花多糖的研究中發現,改變微波提取功率其單糖組分中除鼠李糖外其他七種單糖含量的變化較大。因此,可以看出微波提取功率對多糖中含量低的單糖組分影響較小,且影響類別與程度存在底物差異性。

表3 解釋的總方差Table 3 Total variance of interpretation

表4 成分得分矩陣及成分得分系數矩陣Table 4 Component score matrix and component score coefficient matrix

圖4 不同微波提取功率條件下ASP中單糖主成分荷載圖Fig.4 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different microwave extraction power

2.1.3 不同微波提取溫度條件下ASP中單糖組分分析 由圖5可以看出,提取溫度為40～90 ℃的過程中,隨輻照溫度的增大,單糖的組成均發生了不同程度的變化。雖然在該條件下,每種單糖的含量未呈現出規律性的變化,但在該提取溫度范圍內隨著溫度的升高,各單糖的含量均存在一個最大值和最小值。因此可以發現提取溫度區間在50～70 ℃,對有效保留不同單糖組分有著明顯的作用。劉超[40]在研究中也發現用微波輔助提取羊肚菌胞內多糖的過程中,在提取溫度為70 ℃的條件下半乳糖含量最高,半乳糖組分得到了有效的保留。此外,從實驗數據可以看出提取溫度導致ASP單糖組分含量的變化程度均小于微波提取時間和功率。

圖5 微波提取溫度對ASP各單糖組分含量的影響Fig.5 Influence of microwave extraction temperature on the monosaccharide composition content of ASP

在不同提取溫度條件下的ASP中,提取出了兩個主要成分同2.2.1,第一主成分特征值=3.372>1,貢獻率為59.196%,第二主成分的特征值=1.685>1,貢獻率為28.087%,且累計貢獻率到達84.283%,即兩個主成分全面地解釋了不同提取溫度條件下六種單糖變化程度的84.283%。表6和圖6代表了提取出的主成分與原始數據之間的相關程度,即提取出的主成分含有的原始變量的數據。從表6中可以看出,第一主成分和第二主成分分別與葡萄糖和甘露糖的相關系數接近1,分別說明較全面的包括了葡萄糖和甘露糖的變化信息,而其他糖的信息涵蓋較差,并且對第二主成分的解釋程度較差。因此在不同提取溫度條件下提取的ASP中,

表5 解釋的總方差Table 5 Total variance of interpretation

表6 成分矩陣及成分得分系數Table 6 Component matrix and component score coefficient

圖6 不同溫度條件下ASP中單糖主成分荷載圖Fig.6 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different extraction temperature

葡萄糖的變化程度大于甘露糖,且變化幅度明顯大于其他單糖組分。研究說明利用微波提取ASP在改變提取溫度的條件下僅對葡萄糖含量的影響最為明顯。與2.2.1和2.2.2相比,提取溫度這一因素,在微波輔助提取ASP的過程中影響權重較低。這是因為微波本身可以在短時間內產生很大的熱能[16],破壞活性物質的穩定性,在一定溫度范圍內改變提取溫度條件,對提取物質的影響很小[17]。

3 結論

本研究對微波輔助提取ASP的單糖組成及組分含量的分析結果表明隨著微波提取條件(輻照時間、輻照功率和提取溫度)的增加,各單糖組分含量均呈現先增加后降低的總體變化趨勢。通過SPSS對不同處理條件下得到的單糖組分數據進行主成分分析研究,可以發現微波提取時間、功率和溫度三種影響因素均導致ASP中主要單糖組分含量明顯變化,其中微波提取時間的改變對單糖組分的影響最為顯著。本研究為微波輔助提取技術在多糖領域中的應用及工藝優化提供了技術支持和數據支持。