高良姜素對肝癌細胞HepG2的凋亡效應

劉 政,王 會(錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

肝癌是發生在肝細胞或膽管細胞的惡性腫瘤,具有治愈難、預后差等特征,其治療是臨床亟待解決的問題。尋找安全有效、靶點明確、低毒的天然抗腫瘤藥物是科學界研究的焦點,從中草藥中篩選有效的活性物質治療肝癌是中藥發展的重要渠道。

高良姜素是天然的黃酮醇類化合物(3,5,7-三羥基黃酮,圖1),可從植物高良姜植株的地上部分[1]及根莖[2-3]和蜂膠[4]中提取得到。研究發現,高良姜素具有鎮痛、止嘔、抗氧化作用[5]及抗腫瘤作用[6-7]。高良姜素可抑制皮膚癌[8]、人骨瘤MG-63[9]、肝癌BEL-7402[10]腫瘤細胞的增殖和轉移,能夠誘導肺癌A549細胞的凋亡[11]。本實驗檢測高良姜素對肝癌細胞HepG-2的細胞毒性,應用形態學分析、凋亡率檢測進行凋亡作用測定,并初步探討高良姜素對細胞周期、線粒體膜電位及胞內鈣離子穩態的影響。本文研究高良姜素對肝癌細胞HepG-2增殖及凋亡作用,為高良姜的開發利用提供實驗依據。

圖1 高良姜素的結構式Fig.1 The structural formula of galangin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高良姜素(純度≥98.0%)、喜樹堿(純度≥98.0%) 成都曼斯特生物科技有限公司;人肝癌HepG-2 細胞 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所遺傳資源實驗室提供;胎牛血清、DMEM高糖培養基 美國GIBCO公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI) 美國Sigma公司;Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒、JC-1探針 美國BD公司;Fluo-3/AM 美國Invitrogen公司。

BB15 CO2培養箱 德國Heraeus公司;IX-71倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司;Multiskan FC酶標儀 美國Thermo Fisher公司;FC-500流式細胞儀 美國Beckman公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 HepG-2 細胞培養于含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養基中,培養環境為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。當細胞達到70%～80%融合度時用0.25%胰酶消化細胞并傳代,取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 藥物配制 高良姜素和喜樹堿先用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,然后再溶于培養基(DMSO終濃度小于0.05%)。配制培養基分別含有高良姜素濃度為2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL;含有喜樹堿濃度為6.96、13.92和27.84 μg/mL,備用。

1.2.3 細胞毒性分析 取180 μL細胞懸液接種于96孔培養板,細胞進入對數生長期時分別換用含有2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素的培養基培養,設置空白對照組(用含DMSO的培養基處理,DMSO終濃度為0.05%)和陽性對照組(以喜樹堿為陽性對照,6.96、13.92和27.84 μg/mL)[12-13],每組設5個重復,作用時間分別為12、24、36、48 h,然后每孔加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)20 μL(5 mg/mL),繼續培養4 h,棄培養基。每孔加入200 μL DMSO,充分振蕩,酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度OD值。

1.2.4 細胞形態學分析 細胞接種于六孔板(3.0×105cell/孔),待24 h后細胞進入對數生長期[14],分別用2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理細胞24 h,并設空白對照組(用含DMSO的培養基處理,DMSO終濃度為0.5%)和陽性對照組(以喜樹堿為陽性對照,27.84 μg/mL)。應用倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率 細胞接種24 h進入對數生長期,收集經2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素和27.84 μg/mL喜樹堿(陽性對照)處理12、24、36、48 h的各組細胞及空白對照組(用含DMSO的培養基處理,DMSO終濃度為0.5%)細胞,調整細胞濃度為5.0×105cell/樣品,每個樣品分別加入100 μL緩沖液和5 μL AnnexinV-FITC及5 μL PI。混勻,避光孵育10 min,流式細胞儀檢測。

1.2.6 細胞周期檢測 細胞接種24 h進入對數生長期,經高良姜素處理24 h,收集經2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理的細胞和空白對照組(用含DMSO的培養基處理,DMSO終濃度為0.05%)細胞,調整細胞濃度為5.0×105cell/樣品,細胞于70%無水乙醇,4 ℃處理12 h。PBS洗滌2次,加入0.5 mL PI染液,4 ℃ 避光孵育15 min,流式細胞儀檢測。

1.2.7 線粒體膜電位檢測 細胞接種24 h進入對數生長期,經高良姜素處理24 h,收集經2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理的各組細胞和空白對照組(用含DMSO的培養基處理,DMSO終濃度為0.5%)細胞,調整細胞濃度為1.0×106cell/樣品,加入0.5 mL JC-1染色液,于培養箱避光孵育20 min,用37 ℃預熱的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌,0.5 mL PBS 懸浮,流式細胞儀檢測。

1.2.8 細胞內鈣離子濃度的測定 細胞接種24 h進入對數生長期,收集經2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理24 h的各組細胞和空白對照組(用含DMSO的培養基處理,DMSO終濃度為0.5%)細胞,調整細胞濃度為1.0×106cell/mL。加入Fluo-3/Am(終濃度為8 μmol/L),于培養箱避光孵育30 min,期間振蕩4次,設置陰性對照(不加Fluo-3/Am)。用無鈣離子PBS漂洗2次,PBS重懸至0.5 mL,流式細胞儀檢測。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 細胞毒性分析

MTT法細胞毒性分析是檢測細胞存活和增殖活性的最常規、最經典的方法。不同濃度高良姜素分別作用HepG-2細胞12、24、36、48 h,OD490值反映的是活細胞數量,OD490值減小,顯示活細胞數量減少。高良姜素處理細胞12 h時,21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值與空白對照組比較減小,差異顯著(P<0.05)。其中,5.4 μg/mL濃度組OD490值大于2.7 μg/mL濃度組OD490值,但兩組相比較差異不顯著,推測出現這種現象的原因可能是兩個濃度的高良姜素作用細胞12 h未對細胞產生差異的毒性作用。高良姜素處理細胞24 h時,10.8 μg/mL高良姜素處理組OD490值與空白對照組比較減小,差異顯著(P<0.05);21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值與空白對照組比較減小,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細胞36 h時,5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值分別與空白對照組比較均減小,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細胞48 h時,5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值分別與空白對照組比較均減小,差異極顯著(P<0.01)(表1)。在同一作用時間,隨著高良姜素濃度的增大其OD490值逐漸減小,顯示活細胞數量減少,呈現量效關系。陽性對照喜樹堿處理的各組細胞OD490值隨其濃度增大也減小,高良姜素處理組與陽性對照組比較,表現出良好的細胞毒性作用,該實驗結果與高良姜素對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的作用結果一致[12],為后續的凋亡作用研究提供基礎。

表1 高良姜素對HepG-2細胞生長的影響(n=3)Table 1 Effect of galangin on growth of HepG-2(n=3)

2.2 細胞形態學觀察

對照組細胞飽滿、立體感好,排列緊密,邊緣清晰,細胞折光度好。高良姜素處理24 h后,2.7 μg/mL處理組細胞未出現明顯變化;5.4 μg/mL處理組細胞出現空泡,胞體縮小;10.8 μg/mL處理組細胞形態變得模糊不清,空泡及細胞碎片增多;21.6 μg/mL處理組細胞間連接幾乎消失,胞體縮小,細胞膜皺縮,細胞膜表面凹凸不平,細胞裂解成較小的碎片,出現細胞壞死。喜樹堿27.84 μg/mL處理組細胞凋亡現象和高良姜素21.6 μg/mL處理組相似(圖2)。隨著高良姜素處理濃度的增大細胞發生凋亡作用的形態表現愈加嚴重。

圖2 高良姜素處理HepG-2細胞24 h細胞形態(40×)Fig.2 Cell morphology of HepG-2 treated with galangin at 24 h(40×)

2.3 細胞凋亡率的測定

雙標記法能夠定量分析細胞凋亡,并可定量分析凋亡細胞和壞死細胞。檢測結果顯示,高良姜素處理細胞12 h時,10.8 μg/mL高良姜素處理組凋亡率與空白對照組比較增高,差異顯著(P<0.05),21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細胞24 h時,5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率分別與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細胞36 h時,5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率分別與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細胞48 h時,5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率分別與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。隨著高良姜素作用濃度的增大,凋亡率逐漸增大,且呈現濃度依賴性。各處理時間的陽性對照喜樹堿27.84 μg/mL處理組凋亡率高于高良姜素21.6 μg/mL處理組(表2)。

表2 高良姜素處理HepG-2細胞凋亡率(%)(n=3)Table 2 The apoptosis rate of HepG-2 treated with galangin(%)(n=3)

2.4 細胞周期檢測

細胞周期是個連續的動態過程,如某環節受到干擾,必將影響細胞增殖進而影響整個生命活動。細胞周期的不同時相必須高度精確有條不紊的進行,細胞必須在完成上一次時相后才能進入下一個時相。將細胞周期的理論應用于藥物研究,其作用機制為時相特異性,將細胞阻止在特定的時相。高良姜素誘導肝癌BEL-7402細胞凋亡的研究結果表明,高良姜素阻斷細胞于G1期,且呈現劑量依賴性[15]。本文檢測結果顯示,高良姜素處理細胞24 h時,5.4 μg/mL高良姜素處理組,處于G1期細胞的數量增多,與空白對照組比較差異顯著(P<0.05);10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組,處于G1期細胞的數量增多,與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01);10.8、21.6 μg/mL高良姜素處組,處于S期細胞的數量增多,與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01);21.6 μg/mL高良姜素處理組,處于G2期細胞的數量減少,與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。隨著高良姜素濃度的增大,處在G1期細胞數增多,S期細胞數下降,G2期細胞數下降,表明細胞經高良姜素處理后增殖停滯在G1期,DNA合成受阻,這種關系隨著高良姜素劑量的增大而愈加明顯,呈現劑量依賴性(表3)。

表3 高良姜素處理HepG-2細胞24 h,細胞周期的變化(n=3)Table 3 Changes in the cell cycle of HepG-2 treated with galangin for 24 h(n=3)

2.5 線粒體膜電位檢測

隨著對細胞凋亡機制不斷研究,細胞器線粒體得到了前所未有的關注。線粒體在細胞凋亡的過程中起著調控器的作用。線粒體跨膜電位的下降被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件,它發生在細胞核凋亡特征出現之前,一旦線粒體跨膜電位崩潰,則細胞凋亡不可逆轉。研究顯示,高良姜素誘導肝癌BEL-7402細胞線粒體膜電位下降[15]。本文檢測結果顯示,高良姜素處理細胞24 h時,5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組線粒體膜電位下降,與空白對照比較差異極顯著(P<0.01)(表4)。隨著高良姜素處理濃度的增大線粒體膜電位越低,呈現劑量依賴性,表明細胞發生凋亡作用程度越嚴重。

表4 高良姜素處理HepG-2細胞24 h,線粒體膜電位變化(n=3)Table 4 Mitochondrial membrane potential changes of HepG-2 treated with galangin for 24 h(n=3)

2.6 細胞內游離鈣離子測定

鈣離子作為第二信使在細胞乃至整個有機體生命活動中起著重要的調控作用。細胞內鈣離子濃度的變化直接影響細胞的增殖、分化及凋亡等生命現象,因此,鈣作為第二信使在細胞凋亡中的作用一直是細胞生物學研究的重點。細胞質內游離鈣離子的增多和內質網內鈣離子的排空均可激活凋亡啟動因子。目前認為鈣離子信號可能是通過細胞或線粒體鈣超載和鈣依賴酶激活這兩種方式來控制凋亡的。檢測結果顯示,高良姜素作用細胞24 h時,5.4 μg/mL高良姜素處理組細胞內游離鈣離子濃度增高,與空白對照比較差異顯著(P<0.05);10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組細胞內游離鈣離子濃度增高,與空白對照比較差異極顯著(P<0.01)(表5)。隨高良姜素濃度增大,細胞內游離鈣離子濃度逐漸增高,呈現劑量依賴性,表明細胞發生凋亡作用程度越嚴重。

表5 高良姜素處理HepG-2細胞24 h,胞內Ca2+濃度的變化(n=3)Table 5 Intracellular Ca2+ concentration changes of HepG-2 treated with galangin for 24 h(n=3)

3 討論與結論

腫瘤的發生、發展是復雜的基因調控失調所致,是細胞增殖和凋亡平衡被打亂的結果。隨著人們對凋亡機理的研究,發現促進腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的有效途徑之一。

細胞毒性結果表明,高良姜素可以抑制人肝癌HepG-2細胞生長,并呈現時間-效應和劑量-效應依賴關系,這與先前的研究結果相似,高良姜素可體外抑制多種癌細胞增殖,如乳腺癌[16]、肺癌[17]、口腔癌[18]和白血病細胞[19]。細胞形態學分析及凋亡率檢測結果和細胞毒性結果一致。

腫瘤是一種細胞周期失控性疾病,細胞無限增殖,導致細胞惡性轉化,最終形成腫瘤[20],對細胞周期進行檢測是研究細胞凋亡的重要指標之一,通過干擾細胞周期進程來誘導凋亡也作為抗腫瘤研究的一個新思路[21]。檢測高良姜素對HepG-2細胞周期的影響,發現細胞發生G1期阻滯,導致進入G2期細胞數量減少,造成進入M期的細胞數量減少,細胞分裂受阻,細胞發生凋亡。本實驗結果與先前研究結果存在差異,有報道顯示,高良姜素導致肝癌HepG-2[22]、肺癌A549細胞[23]和胃癌SGC-7901細胞[24]發生G2/M期細胞周期停滯,從而抑制其增殖。推測高良姜素通過干擾細胞周期時相的分布從而促進細胞凋亡,這為以后開展高良姜素誘導肝癌細胞凋亡機理的研究提供了重要實驗依據。

線粒體與細胞凋亡過程中許多重要事件相關,并在其中發揮著重要的調控作用[25],線粒體膜電位下降,膜通透性轉運孔開放,線粒體內的細胞色素C、凋亡誘導因子外流進入細胞質,從而激活Caspase凋亡途徑啟動凋亡程序[26]。研究表明,高良姜素可使人肝癌細胞線粒體膜電位降低,從而促進細胞色素C釋放到細胞質中,誘導細胞凋亡[27-28]。本實驗采用JC-1探針標記應用流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化,發現經高良姜素處理后的HepG-2細胞線粒體膜電位降低,并呈現劑量-效應依賴關系。推測高良姜素誘導HepG-2細胞凋亡與細胞凋亡線粒體途徑有關。

在正常生理狀態下,細胞中Ca2+主要與蛋白質結合形成結合態封存在線粒體和內質網中,游離的Ca2+很少,當收到外界刺激時結合態變為游離態充當信號分子。游離Ca2+在細胞內的過度累積可以致使細胞凋亡的發生[29-30]。當高良姜素處理HepG-2細胞時,細胞質內游離Ca2+濃度升高且呈現劑量-效應依賴關系,Ca2+穩態被打破,適當濃度的高良姜素可誘導HepG-2細胞發生凋亡。結合線粒體膜電位下降的結果,推測與線粒體內鈣離子的釋放有關,但其具體機理還需進一步的研究。

綜上所述,高良姜素可阻滯細胞增殖、誘導細胞凋亡,其機制可能是通過干擾細胞周期進程及鈣離子穩態和降低線粒體膜電位來誘導細胞凋亡的。