卵轉(zhuǎn)鐵蛋白生物活性肽功能研究進展

馬 斌,張 琪,付 星,金永國(華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

研究表明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解制備的小分子肽具有很好的生物活性,常用的蛋白酶主要有胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶[6]。這些酶具有不同的水解特性,可以生產(chǎn)不同序列的肽,最終表現(xiàn)出功能的特異性[7]。此外,為了分離純化和鑒定生物活性肽,常用的方法有超濾、凝膠色譜、離子交換色譜、反相液相色譜等,多種方法結(jié)合可以達到更好的分離效果[8]。據(jù)現(xiàn)有的文獻報道,酶解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白得到的功能性多肽有降血壓[9-10]、抗氧化[11-13]、抗病毒[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、抗癌[17]等生物活性,且它們的分子質(zhì)量都小于10 kDa,這與低分子量肽與高生物活性之間的正相關性的結(jié)論相一致[18]。雖然單一序列多肽的制備過程比混合物的更加復雜,但仍然有大量文獻報道多肽的分離純化,目的是為了獲得具有高活性、靶向性、低毒性以及在預防和治療慢性疾病方面具有很好的治療潛力的天然多肽[19]。本文主要闡述蛋白酶水解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽的生物學活性以及卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽的應用前景。

1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解工藝

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解的蛋白酶主要來源于人工提純的酶,如:胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等。由于水解過程中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構被破壞,且這些蛋白酶具有不同的酶切位點和水解條件(溫度、pH、加酶量等),因而可以獲得不同大小、不同氨基酸序列的多肽[20]。生物活性肽在整個酶解過程中被釋放并激活,從而對機體功能和人體健康產(chǎn)生積極影響[21]。蛋白水解產(chǎn)物的成分與水解條件存在必然的聯(lián)系,隨著水解時間、溫度、pH的改變對肽的組成和結(jié)構有著很大的影響[22]。例如,在其他水解條件都相同的情況下,使用胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶酶解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白。將嗜熱菌蛋白酶的水解溫度從60 ℃降到55 ℃,可分別得到具有抗氧化和抗高血壓兩類不同生物活性的多肽[23-24]。另外,經(jīng)過promod 278P酶和嗜熱菌蛋白酶水解6 h后,水解產(chǎn)物具有很好的抗氧化活性[25]。相似的研究表明,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在胃蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合水解15 min后的水解產(chǎn)物具有明顯的免疫活性[26],而只用胰蛋白酶水解4 h后得到的多肽,卻具有較好的抗菌活性[27]。因此,酶解產(chǎn)物的生物活性不僅與酶解條件有關,還與蛋白酶的種類息息相關[28-29]。表1總結(jié)了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白不同生物活性肽的制備條件。

1.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解產(chǎn)物的制備

因卵轉(zhuǎn)鐵蛋白整個酶解產(chǎn)物比某一個肽段具有更大的生理相關性因而被研究[30]。日常飲食中,人體攝入的蛋白經(jīng)胃腸道的消化后,形成多肽或氨基酸而被人體利用,因而整個酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出的生物學效應是極其復雜的[31]。因此,目前應用于功能性食品開發(fā)的主要是蛋白水解后的混合物,而純肽在醫(yī)學領域中的應用較多[32]。已有大量的研究結(jié)果表明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白整個水解產(chǎn)物包含大量的多肽和氨基酸,這個復雜的混合體系同樣具有各種生物活性,例如:抗氧化活性、抗癌活性、免疫調(diào)節(jié)、ACE抑制活性等[33]。

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的水解產(chǎn)物可以通過體外酶解和微生物發(fā)酵來獲得。微生物發(fā)酵是由細菌或真菌分泌的蛋白酶水解培養(yǎng)基中的蛋白來獲得水解產(chǎn)物[34]。目前,從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中制備水解產(chǎn)物主要是利用蛋白酶進行體外酶解。Kim等利用不同的蛋白酶水解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白制備的水解產(chǎn)物具有很好的抗氧化性,且抗氧化能力優(yōu)于蛋白本身[35]。Moon等使用promod 278P酶在45 ℃水解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白3 h后獲得的水解產(chǎn)物展示了很強的ACE抑制活性[33]。此外,Lee等利用兩步酶解法水解該蛋白獲得的水解物,顯示出很強的抗癌能力[25]。為了進一步探索卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解產(chǎn)物的功能活性,利用蛋白酶進行酶解,以獲得對人體健康有潛在生理益處的酶解產(chǎn)物是很有必要的[36-37]。因卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解產(chǎn)物豐富的功能活性,酶解產(chǎn)物簡單易得,可以直接添加到產(chǎn)品中,所以它有良好潛力應用于食品工業(yè)[38]。

1.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽的制備

為探究整個酶解產(chǎn)物中具體起生物活性作用的多肽,以便進一步闡明活性物質(zhì)促進人體健康的作用方式,因此,將酶解產(chǎn)物分離純化成為眾多學者的研究重點。在1998年,Ibrahim等人從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解液中成功純化出抗菌結(jié)構域。將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白用稀釋酸水解后將抗菌活性最高的水解物溶于蒸餾水中,利用凝膠色譜柱Sephadex G-50(2.2 cm×100 cm)進行分離,用pH5.5的0.1 mol/L吡啶-乙酸鹽緩沖液平衡,并洗脫色譜柱。收集到活性最高的組分進一步用反向液相色譜柱Wakosil-II 5C18-200(4×250 mm)分離。抗菌活性最高的組分用RasoMol ver.2.6分析鑒定抗菌肽的序列[39]。

目前,截留分子量(MWCO)超濾膜的使用進一步加快了生物活性肽的富集,MWCO超濾膜可去除未水解蛋白、蛋白酶和分子量較大的多肽片段,從而獲得高活性的小分子量多肽[40]。研究表明,采用10 kDa或分子量更低的MWCO膜過濾后,水解產(chǎn)物的ACE抑制作用和抗氧化作用會提高,這可能是由于低分子量多肽與高生物活性之間存在正相關性[41]。超聲處理后的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白被水解獲得含有抗氧化肽的混合物,再進一步通過陽離子色譜柱HiPrep 16/10 SP FF(100 mm×16 mm,90 μm)和反相高效液相色譜柱XBridge C18(150 mm×10 mm,5 μm)分離得到抗氧化肽,使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對肽序列進行分析鑒定,并分析了氧自由基吸收能力[24]。同樣的分離方法,從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解混合產(chǎn)物中ACE抑制活性肽也被鑒定出來[23]。由于酶解方法不同導致多肽序列的差異,因此在分離和純化過程中,還需要根據(jù)研究目的選擇酶解方法和色譜柱。此外,質(zhì)譜的發(fā)展為解析多肽序列的結(jié)構和組成提供了強有力的技術支持[42]。

多肽的結(jié)構特征也可決定其生物活性,例如親/疏水性、電荷肽、氨基酸組成、空間結(jié)構以及肽溶解度,而且純化方式對于獲得特異性生物活性多肽有重要作用[43-44]。除此之外,利用肽切割器軟件模擬蛋白酶酶切位點也可獲得具有不同生物活性的多肽。Yu等[45]模擬胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶切位點切割卵轉(zhuǎn)鐵蛋白序列后獲得了18種二肽,并通過化學合成后驗證其抗炎活性。

2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽的生物學活性

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白一直因其豐富的生物活性而被普遍研究,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解可制備大量的活性多肽,其生物學活性有潛力為人類健康提供特定益處[10]。例如,抑制細菌和病毒生長、預防慢性疾病、降低血壓和抑制腫瘤細胞的增殖、提高人體免疫力等[46-47]。表1總結(jié)了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽生物學活性。

2.1 抗菌活性

由于細菌耐藥性的增強和食品防腐劑的潛在危害,天然抗菌肽表現(xiàn)出了良好的抗菌效果,如能被很好地開發(fā)利用,有望給生物制藥、臨床醫(yī)學、食品防腐及保鮮等食品加工方面等領域帶來廣闊的應用前景[48-50]。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽顯示出較強的抗菌活性,且有廣譜的抗菌性[16]。首次從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中鑒定出的多肽被命名為OTAP-92,該肽由卵轉(zhuǎn)鐵蛋白N末端的109～200位氨基酸序列組成。OTAP-92仍然保持著由6個半胱氨基酸所形成的3個分子內(nèi)二硫鍵維持的三級結(jié)構,它具有破壞細胞膜的生物功能進而殺死細菌[39]。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抗菌肽的抗菌活性,不僅是由于特定的空間結(jié)構,還有一些特殊氨基酸殘基可以積聚在細胞膜表面形成通道從而導致細胞死亡,其中帶正電荷的精氨酸和促進肽形成折疊結(jié)構的色氨酸是抗菌肽特有的性質(zhì)[27]。

2.2 抗病毒活性

研究發(fā)現(xiàn),乳鐵蛋白被蛋白酶消化后得到的肽段對單純皰疹病毒具有抗病毒活性[51]。因卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白具有明顯的序列和結(jié)構同源性,所以卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對禽皰疹病毒馬立克氏病病毒的抗病毒活性被研究[52]。隨后在卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中尋找與牛乳鐵蛋白片段具有序列同源性的抗病毒活性片段:DQKDEYELL(219-227)和 KDLLFK(269-301和633-638),這兩種肽雖然能夠阻止馬立克氏病病毒對雞胚成纖維細胞的感染,但是抗病毒活性卻低于蛋白,這可能是由于多肽與蛋白質(zhì)分離時構象發(fā)生了變化,不能夠發(fā)揮在完整蛋白中的作用,導致多肽的抗病毒活性下降[14]。

2.3 抗氧化活性

隨著人們對合成抗氧化劑安全問題的重視,來源于食品中的天然抗氧化物質(zhì)引起了廣泛的研究興趣。從蛋清蛋白中獲得的生物活性肽可能成為很好的抗氧化物質(zhì)來源。已有研究表明,抗氧化活性是卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽重要的功能特性之一[53]。嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶水解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白后產(chǎn)生了14種具有自由基吸收能力的抗氧化活性肽,其中,GWNI和WNIP兩個氨基酸序列展示出最高的抗氧化活性,其氧自由基吸收值分別15.47和13.90 μmol/μmol。這兩個肽具有相同的氨基酸序列WNI,若在這兩個肽的兩端添加其他氨基酸后其抗氧化值會下降,表明這三個氨基酸與多肽的抗氧化活性高度相關[24]。但是,研究發(fā)現(xiàn)這14種抗氧化肽沒有顯示出任何抗炎活性[54]。Yi等[55]和Daniel等[56]驗證了ACE抑制肽IRW的抗氧化活性,證明IRW能有效的保護Caco-2細胞免受氧化應激損傷,抑制細胞內(nèi)ROS的積累,從而避免因過度的ROS聚集導致的心血管疾病、肝損傷和癌癥等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。此外,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白還可以通過與小分子的結(jié)合來提高蛋白質(zhì)的抗氧化活性[11],例如兒茶素主要是結(jié)合了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白N型葉中DLLFKDSAIMLK的賴氨酸(殘基316-327)和FFSASCVPGATIE的谷氨酸(殘基174-186)從而使其抗氧化效果顯著增強[13]。這些結(jié)果說明,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抗氧化肽可以作為一種潛在的天然抗氧化劑。

2.4 抗ACE活性

ACE將無活性的十肽血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管收縮劑血管緊張素II,同時還催化緩激肽水解,從而導致血壓升高[57]。ACE也可促使腎上腺醛固酮的釋放,該激素增強腎小管鈉的重吸收并導致血壓升高[58-59]。盡管眾多的合成藥物被用來抑制AEC,從而緩解高血壓的癥狀。因存在一定的副作用,很多的研究開始關注天然ACE抑制肽。源于卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的多肽因具有明顯的ACE抑制活性而被大量的研究。體外實驗證明氨基酸序列為KVREGTTY有抑制ACE活性,IC50值為102.8 μmol/L,高血壓大鼠體內(nèi)被注射該肽后,血壓顯著降低[60]。研究者從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白鑒定出IQW、IRW和LKP三種ACE抑制肽,其IC50值分別為1.54、0.62和2.93,結(jié)果表明這三種肽有顯著得降壓作用[23,61]。Liu等[62]也對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白ACE抑制肽的篩選進行了研究,他們獲得了一種效果顯著的ACE抑制肽RVPSL,其IC50值為20 μmol/L。

IRW是一種卵轉(zhuǎn)鐵蛋白典型的ACE抑制肽,通過研究IRW在Caco-2細胞中的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運情況,發(fā)現(xiàn)IRW可能被全部地吸收到抑制高血壓的作用部位,從而起到降血壓的效果[63]。三肽EWL是一種由卵轉(zhuǎn)鐵蛋白通過計算機模擬酶解的方式獲得的ACE抑制肽,其IC50值為(380±10) μmol/L,可見其抑制效果極其顯著[45]。由此可知,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白ACE抑制肽是治療高血壓極有潛力的替代品。

2.5 抗炎活性

因抗炎藥物療效的局限性,眾多的學者開始研究天然產(chǎn)物作為治療炎癥的安全替代品,如蛋白質(zhì)、生物活性肽、氨基酸都可以緩解或改善腸道炎癥[64-65]。多肽已被證實能調(diào)節(jié)腸道免疫功能和減輕炎癥反應,并有望成為治療炎癥的新途徑[67-68]。Wang等[68]通過計算機模擬胃蛋白酶和胰蛋白酶消化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,從模擬的消化產(chǎn)物中獲得的五種二肽均能顯著抑制促炎因子的基因表達,從而減輕腸道炎癥。此外,研究發(fā)現(xiàn)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白衍生肽IRW和IQW還可以有效的抑制靜脈內(nèi)皮細胞腫瘤壞死因子誘導的炎癥反應[15]。通過大鼠模型探究了IRW對促炎性細胞因子的影響,發(fā)現(xiàn)IRW能抑制IL-8,細胞間細胞粘附分子-1和血管細胞粘附分子等炎癥介質(zhì)的合成[69]。因此,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白衍生肽作為安全、有益的抗炎藥替代物,具有重要的研究意義和價值。

2.6 抗癌活性

近些年來癌癥成為人類主要死亡因素之一,許多的研究關注于尋找天然抗癌物質(zhì),而卵轉(zhuǎn)鐵蛋白作為一種多功能活性蛋白,也被證明具有抗癌活性。使用8種不同的酶水解蛋清中的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,評價水解產(chǎn)物對人類癌細胞的細胞毒性,揭示卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解產(chǎn)物具有對人類癌細胞的抑制作用[12]。而卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多的酶解產(chǎn)物展示出比天然卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對人癌細胞(人胃腺癌、人結(jié)腸腺癌、人宮頸腺癌、)更強的毒性,其中對人結(jié)腸腺癌細胞的毒性最強,IC50值為0.92[25]。此外,采用非硫醇還原劑(TCEP)還原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白制備rac-OTf,rac-OTf可以抑制結(jié)腸癌(HCT-116)和乳腺癌(MCF-7)細胞增殖并使其凋亡,而對正常人乳腺上皮細胞(HMEC)無明顯影響[17]。由此可見,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解產(chǎn)物和還原產(chǎn)物可作為一種潛在的癌癥防御物質(zhì)。

3 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽的前景

隨著人們的生活方式發(fā)生轉(zhuǎn)變,各種疾病嚴重威脅著人類的健康。鑒于使用合成藥劑所帶來的負面影響,天然來源的轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽因其優(yōu)異的生物活性成為研究的重點[70-71]。心血管疾病是全世界發(fā)病率和死亡率最大的原因之一,而高血壓、氧化應激和炎癥是導致心血管疾病的主要誘因[72-73]。關于卵轉(zhuǎn)鐵蛋白衍生肽的抗高血壓、抗氧化和抗炎的功能特性進行了大量的研究,而這些研究成果證明了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白衍生肽具有優(yōu)異的生物活性,可用于心血管疾病有效治藥物的開發(fā)。人體免疫功能障礙可引起慢性炎癥和自身免疫等多種疾病,樹突狀細胞的活化和功能可能用于這些疾病的預防和治療,而卵轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白酶水解物對樹突狀細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用,能由有效增強人體免疫能力[26,74]。此外,抗菌肽、抗病毒肽、抗癌水解物等,這些源于卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物活性肽和水解物具有促進健康的潛力[75]。本文引用了許多研究,闡述了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白活性肽的各種生物學功能,這將有利于進一步提高活性肽在治療和防御疾病方面的潛在價值。

盡管越來越多的研究支持卵轉(zhuǎn)鐵蛋白活性肽的有益影響,但也面臨一些問題。例如:常規(guī)的酶解方式導致酶的回收利用率低,酶和底物的分離難度大;酶解產(chǎn)物中可純化出高生物活性的肽,但是受產(chǎn)量低及純化過程復雜的限制,實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還存在著巨大的挑戰(zhàn),其次,有些活性肽在消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性不足,在通過人體胃腸道時容易被降解,失去原有的活性;活性肽的具體作用靶點和機制尚不完全清楚;關于卵轉(zhuǎn)鐵蛋白生物活性肽的實際應用較少,目前還是停留在體外和體內(nèi)實驗,在實際食品或保健食品中使用受到限制。

針對目前所面臨的問題,提出以下將來可以研究的方向:為彌補常規(guī)酶解的不足,采用固定化酶技術可有效解決該問題。固定化酶技術不僅可以提高酶的利用率,同時有利于酶和水解物的分離,從而實現(xiàn)酶的重復利用;關于生物活性肽的分離純化過程難度大的問題,可以致力于生物活性肽富集材料的研究,將有利于解決這一難題;此外,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白活性肽還需要有效的遞送材料,例如納米顆粒、微膠囊等遞送材料的開發(fā)需要進一步研究;最后,關于活性肽在體內(nèi)的作用靶點和機制都需要更加深入的研究,為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白生物活性肽能夠很好地應用于實際生產(chǎn)奠定基礎。

4 總結(jié)

蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量較高,功能活性種類繁多,因而開發(fā)前景十分廣闊。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解產(chǎn)物和多肽的生物活性(如抗氧化、抗高血壓、抗菌、抗病毒、抗癌等活性)已受到越來越多的關注,而酶的種類和酶解條件是制備不同生物活性肽的重要因素。從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中獲得的活性肽有極大的潛力用于防御和治療各種疾病(心腦血管疾病、癌癥等),然而在應用之前需要進行嚴格的體內(nèi)和臨床實驗。進一步深入的研究對人類健康有重大意義。