噬菌體應用于污水處理過程的探討

熊文斌,盧 晗,劉新春

(中國科學院大學資源與環境學院，北京 101408)

隨著科技進步與社會發展，人們開始越來越重視水環境的安全問題。在污水處理過程中，現存工藝存在著諸如污泥膨脹等系統運行不穩定問題，影響污水處理效果，并存在病原菌排入環境的安全隱患。

噬菌體是一種有效的抗菌劑，在歐洲一些國家以及前蘇聯地區曾一度試行過用噬菌體療法來治療疾病。后來由于抗生素的發現與使用，噬菌體療法逐漸被人們淡忘。由于耐藥菌的不斷出現，加之新型抗生素研發周期過長，抗生素療法遭遇瓶頸。鑒于此，噬菌體治療再次引起了人們的重視。同時，基因測序技術以及分子生物學的高速發展也為噬菌體技術的應用提供了有利的條件[1-2]。目前，噬菌體已經在醫學[3]、漁業[4]、食品行業[5]等領域開展了相關應用，主要是篩選一些烈性噬菌體，利用其專一性裂解目標細菌這一特性來殺滅一些特定的病原菌。

與噬菌體治療在醫學上的應用類似，噬菌體介導的生物防治技術作為一種經濟手段在緩解飲用水、廢水及其他環境問題方面具有良好的應用前景，是污水處理過程中治理污泥絲狀膨脹、消毒、監測水體等的一個全新的研究方向。為此，本文對噬菌體在污水處理過程中的應用進行了探討，為進一步擴大噬菌體技術的實踐應用提供理論指導。

1 噬菌體的生理特性

圖2 噬菌體在污水處理過程中的應用Fig.2 Application of Phage in Wastewater Treatment

噬菌體是世界上數量最豐富的微生物，水生系統中噬菌體的數量在每毫升104～108[6]。噬菌體是能夠感染細菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，部分能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體[7]。它不具有完整的細胞結構，其單一核酸由蛋白質外殼所包圍。噬菌體普遍由棱柱形頭部內的遺傳物質(被蛋白質衣殼、尖刺和附著于細菌的尾巴纖維包圍)和中空管(尾鞘)這兩部分組成，其遺傳物質從該中空管注入宿主中[8]。噬菌體的特異性取決于其自身的尾纖維蛋白以及細菌細胞表面的特異性受體[9]。

根據噬菌體感染宿主后的生理行為可以將噬菌體大致分為兩類：烈性噬菌體與溫和噬菌體。前者將遺傳物質注入宿主細胞后進行自我復制并表達，在宿主細胞內組裝成子代病毒顆粒，最終使細胞裂解，釋放出子代噬菌體(圖1)。溫和噬菌體的遺傳物質則在進入宿主細胞后與細菌基因組相整合，成為原噬菌體。在一定外界條件刺激下，原噬菌體也會進入裂解循環。

圖1 噬菌體的裂解周期Fig.1 Lytic Cycle of Phage

噬菌體常常具有嚴格的宿主范圍，其原因在于噬菌體的細胞受體具有嚴格的種系特異性。例如，T2和T6噬菌體的細胞受體是大腸桿菌細胞外壁層的脂蛋白，而T3和T5噬菌體的細胞受體是細胞壁中層的脂多糖[10]。因此，在一般情況下，噬菌體只會感染特定的宿主細菌，而不會感染真核細胞生物。

噬菌體復制速度非?？臁蟮?，一個單位的烈性噬菌體感染一個細菌后，只需重復 4 個感染周期，即可殺滅 10 億個細胞[11]。

2 噬菌體在污水處理過程中的應用

受噬菌體在醫學、食品等領域用于處理致病性細菌感染的啟發，研究者們認為噬菌體作為選擇性、自我復制的細菌控制劑在水和廢水處理領域同樣具有應用潛力，能夠在傳統工藝的許多環節中發揮其獨特作用(圖2)。

2.1 活性污泥絲狀膨脹的治理

在活性污泥系統運行不正常的情況下，活性污泥會發生膨脹。活性污泥膨脹分為絲狀膨脹和非絲狀膨脹兩種情況。據報道，約有90%的污泥膨脹為絲狀細菌過度生長而導致的絲狀膨脹[12]。絲狀細菌在適宜的環境條件下過度生長，導致活性污泥非正常膨脹。片狀絮凝物變為絲狀(直徑<10 mm)，絮凝物體積減小，污泥沉降性能變差，出水水質嚴重惡化。

傳統的藥劑如滅菌劑、絮凝劑等僅能暫時控制污泥膨脹，一旦停止投加，很有可能再次發生污泥膨脹。此外，藥劑的投加還有可能對活性污泥中的其他微生物產生不良影響。由此，研究人員提出利用噬菌體作為絲狀菌的專性滅菌劑來控制污泥膨脹，認為噬菌體能夠快速侵染宿主并進入裂解循環，從而達到迅速消滅過度繁殖的絲狀菌的目的。同時，噬菌體具有專一性，不會侵染污泥體系內的其他微生物，對系統的生態穩定性不會造成影響。

目前，已經分離出可以裂解紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)以及戈登氏菌屬(Gordonia)等[13-16]能夠引起污泥膨脹和生物發泡的諾卡氏型絲狀細菌的烈性噬菌體。此外，Petrovski等[17]分離出能夠裂解雅氏四聯球狀菌(Tetrasphaerajenkinsii)絲狀細菌的烈性噬菌體。Dyson等[18]發現，在污泥體系中，83%的諾卡氏型絲狀菌的基因組中疑似攜帶溫和噬菌體序列。通過絲裂霉素C外源物的誘導，能夠使整合在絲狀菌基因組中的原噬菌體進入裂解循環，進行復制與表達噬菌體蛋白質，形成子代噬菌體并裂解細胞。Choi等[19]分離出能夠專性裂解浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)的烈性噬菌體。通過實驗室模擬裝置，檢驗其治理由Sphaerotilusnatans引起的絲狀膨脹的效果，僅在數小時后，污泥體積顯著減小，出水水質得到改善。研究人員發現[20]，噬菌體能在短時間內快速侵染并裂解宿主菌，使污泥沉降能力迅速上升。在投加噬菌體后，絲狀細菌的數量快速下降。經分析發現，原本絲狀絮凝物直徑開始逐漸變大，即污泥體系中的絮凝體尺寸在絲狀菌數量減少后增大，污泥沉降性能得到改善，上清液更清澈。表明，絲狀菌死亡減輕了絲狀菌對絮凝過程的擾動影響，從而使絮凝過程更加穩定。同時，檢測發現，噬菌體應用過程中，污泥體系中COD和氨氮的去除效率無明顯下降。由此說明，噬菌體對活性污泥工藝的正常功能暫無顯著負面影響。當然，目前噬菌體的應用仍局限于實驗室階段，尚無實際應用案例。噬菌體在實際工程中治理污泥膨脹的效能有待進一步實踐探索。

2.2 消毒

近年來，由水體污染帶來的水媒型傳染病的暴發時有發生。據統計，每年因水媒型傳染病造成的死亡人數約占全世界總死亡人數的4%。當前污水處理工藝中主要的消毒工藝是液氯消毒，雖然能夠去除水中大部分的病原菌，但總有殘留，且存在費用高、易產生三氯甲烷等消毒副產物的缺陷[21]。在一些經濟水平不夠發達的國家和地區，水處理技術并不達標，經污水廠排放的處理水中往往存在超標數量的致病菌[22]。

噬菌體在醫學領域上的應用表明其是一種具有優秀抗菌潛力的抗菌劑，能夠特異性地殺滅目標病原菌而不對環境中其他生物造成不良影響。水生環境中，對噬菌體引起的細菌死亡率的估計表明，噬菌體可導致1%～100%的細菌死亡率，這取決于水體環境的營養狀態(表1)[23]。在二級出水消毒環節，可通過直接利用噬菌體特異性地裂解目標菌株及生物膜，或利用噬菌體形成的選擇壓力來選擇生長較慢、更易受殺菌劑或競爭性排斥的噬菌體抗性細菌，來降低目標種群對環境的適應度[24]，以盡量減少出水中耐藥性致病菌的數量，削弱耐藥性致病菌進入環境后帶來的健康風險。

表1 不同水生環境中噬菌體致細菌死亡占細菌死亡率的比率Tab.1 Ratio of Bacteria Fatality by Phage to Total Bacterial Death in Different Aquatic Environments

Beheshti等[22]從河水中分離鑒定了兩株對大腸桿菌PTCC1 399株和大腸桿菌SBSWF27株及當地污水中大腸菌群有裂解作用的噬菌體。以大腸桿菌噬菌體混合物(phage cocktail)處理城市污水，培養2 h后，大腸菌群的最大或然數(MPN)下降了22倍。Dhevagi等[25]分離出的廣譜噬菌體能夠裂解大腸桿菌多種菌株，致力于處理醫院廢水中的耐藥性細菌。此外，一些研究人員嘗試從水樣中分離出了能夠針對其他致病菌的噬菌體。張仲陽等[26]與Leuschner等[27]分別從水樣中分離出針對鼠傷寒沙門氏菌噬菌體Pst87170與PWH2，均證明其對鼠傷寒沙門噬菌有良好的消滅效果，且具有不錯的熱穩定性與酸堿耐受性，具有應用潛力。根據現有的一些關于噬菌體“雞尾酒療法”的研究，可以通過構建新型噬菌體制劑對污水進行消毒。噬菌體不僅具有高效而專一的殺菌效果，且復制速度極快[11]，在污水中存活時間長，擁有類似余氯的持續消毒效果。

同時，在人類使用噬菌體的過程中并沒有出現明顯的感染癥狀[5]。它們僅對具有對應細胞受體的宿主細菌產生感染現象，于人類以及哺乳動物而言暫無顯著負面影響。但是，由于噬菌體對環境條件較為敏感，且基因頻繁地水平轉移，宿主菌或將由此獲得抗生素抗性基因，加劇抗生素治療失效問題。這一現象需要引起相關研究人員的關注。

2.3 監測水體

污水成分復雜，有機物含量高，十分適合各種微生物(包括各種病原菌)的生長。一旦病原菌在適宜的條件下突然暴發，肉眼或一般的檢測儀器無法及時發現，就有可能因為沒有及時采取強化消毒措施而導致疫情的暴發。此外，經物理或化學過程消毒后，一些受損但未死亡的細菌細胞可能會在一定條件下休眠一段時間，進行損傷修復或進入非可培養(VBNC)狀態，并保持致病性[28]。

噬菌體作為傳感器檢測細菌已經在食品[29-31]等領域有所應用(表2)。噬菌體與宿主細菌細胞具有親和力，可作為電化學傳感器的識別元件，還可通過檢測噬菌體裂解細胞后細胞釋放的內容物(如酶和離子等)來檢測細菌。Ben等[32]發現噬菌體對感染性的反應能力及其擴增程度與宿主細胞的活性呈正相關，認為可通過噬菌體感染數據來間接反映水中某些致病菌的存活狀態與數量。噬菌體在宿主表面的成功吸附依賴于噬菌體的尾受體結合蛋白(receptor binding proteins，RBPs)和宿主表面的特異性受體。Xu等[33]通過試驗證明了，具有物種特異性的尾部纖維蛋白對于鑒定宿主具有良好的特異性。利用這一特性，Sedki等[34]提出了一種早期檢測大腸菌群的噬菌體電化學阻抗譜細胞傳感器：以3-巰基丙酸為連接劑，通過共價鍵將噬菌體固定在金納米粒子(AuNPs)表面。大腸桿菌與細胞傳感器表面的M13噬菌體結合，增加了電荷轉移電阻，從而可檢測大腸菌群。該生物傳感器非常靈敏，檢測限(limit of detection，LOD)為14 CFU/mL，且對大腸菌群表現出高選擇性。相較于傳統的細胞計數法、顯微鏡檢查等，更加方便快捷，也比PCR、ELISA等技術更加經濟。不僅如此，尾部蛋白的特性還為拓寬噬菌體宿主范圍提供了新的思路[35]。

表2 基于噬菌體構建的傳感器的原理與檢測限Tab.2 Principle and Detection Limit of Phage Based Sensor

此外，一些試驗證明，噬菌體還可用于檢測某些特定病毒或毒素在污水中的濃度。Xu等[36]利用天然羊駝噬菌體展示納米文庫的巨大多樣性和容量，通過生物掃描篩選出高活性的微囊藻毒素(MC-LR)納米體，通過基因克隆在大腸桿菌BL21中表達陽性MC-LR納米體蛋白，并建立MC-LR的IC-ELISA檢測方法，具有靈敏度高、準確性好等特點。

3 噬菌體應用的局限性

研究者們對噬菌體在污水處理方面的應用潛力做出了諸多構想與嘗試。盡管有醫學、農業等領域應用噬菌體的經驗，但要真正實現噬菌體在污水處理領域的廣泛應用，仍有一些局限需要突破。主要分為3個部分：噬菌體過于窄的宿主譜、可能攜帶有毒性或耐藥性基因、細菌可能會產生對噬菌體的抗性(表3)。

表3 噬菌體應用的局限性Tab.3 Limitations of Phage Application

3.1 宿主范圍

噬菌體特殊的宿主范圍使其能選擇性解決醫療、污水處理等領域的問題，但同時也使噬菌體治理污水存在一定局限。

噬菌體吸附于宿主細胞并注射遺傳物質的過程非常嚴格，受限于特殊的細胞受體與自身的病毒吸附蛋白[37]。因此，噬菌體的宿主范圍十分有限。面對污水處理系統中復雜的細菌組成，很難找到一種或幾種噬菌體能夠覆蓋全部的目標細菌。同時，由于我們對噬菌體與宿主之間的吸附作用了解過少，噬菌體制劑的研發難度大大增加。

研究者們提出建立“噬菌體銀行”以及“噬菌體雞尾酒銀行”，即將已知的噬菌體及其相關敏感宿主進行數據分類并構建檢索工具，在發現致病菌后可以迅速找出相關敏感噬菌體并調制出合適的“噬菌體雞尾酒”[38]。此外，一些研究人員認為可以利用基因工程的手段，擴寬噬菌體的宿主譜。例如，將寬譜噬菌體的宿主譜決定基因替換至窄譜噬菌體的基因組中。陳綿綿等[39]發現，在替換噬菌體基因之后，窄譜噬菌體的宿主譜被擴寬，且其后代同時繼承了二者的宿主譜。

3.2 有毒性或耐藥性基因

在自然環境中，噬菌體是推動細菌進化的重要動力，二者之間存在著頻繁的基因水平轉移。因噬菌體可能會攜帶有毒性或耐藥性基因[40]，在噬菌體侵染宿主的過程中也很有可能將這種基因轉入宿主細胞。

曾振靈等[41]發現不同環境來源噬菌體的基因組中攜帶有大量的耐藥性基因(ARG)，這些噬菌體極有可能將這些基因轉導至宿主細胞內，使宿主細胞獲得耐藥性。噬菌體基因水平轉移的方式多樣，有轉導、轉化等轉移方式[42]。

研究人員在食品、農田土壤等領域均檢測出含ARG的噬菌體顆粒，這些噬菌體能長時間存活并可能成為耐藥性基因傳遞的載體[43-44]。Gabashvili等[45]研究發現，噬菌體轉導參與了一些人類和動物細菌病原體自然種群中與抗生素抗性相關的blaCTX-M、mel和tetM基因座的跨基因傳播。

因此，在將噬菌體投入實際應用時，特別是應用于環境工程等可控能力不強的領域時，必須明確所使用的噬菌體有無毒性或耐藥性基因，以保證制劑的有效性，需防止產生新的“耐藥細菌”。

3.3 抗噬菌體細菌的產生

Synnott等[46]從生活污水進水中分離出金黃色葡萄球菌特異性裂解噬菌體。在分批共培養試驗[47]中，金黃色葡萄球菌對該噬菌體Φ產生了耐藥性。研究人員猜測，噬菌體的使用常常給抗噬菌體細菌的選擇帶來壓力，從而導致耐藥性的出現。

細菌在噬菌體的選擇壓力下進化出一系列抗性機制，包括限制修飾系統(R-M系統)、簇狀規則散布的短回文重復序列-Cas系統(CRISPR-Cas系統)等[48]。噬菌體也進化出了抗CRISPR蛋白等物質或機制來打破細菌的抗性機制，使細菌對其重新敏感[49]。

在自然條件下，細菌會進化出對噬菌體的抗性，噬菌體也在不斷地進化和適應，以期產生新的蛋白或新的感染機制。二者的協同進化在自然界中十分常見，但在噬菌體實際應用時，則體現在投加噬菌體之初有非常好的殺菌效果，但是當細菌數量減少到一定水平時，細菌死亡的速度開始減緩并最終趨于平衡，使得噬菌體治療的最終效果未知[50]。噬菌體導致的抗藥性細菌的出現是實現噬菌體應用的重要障礙，深入了解噬菌體抗性機制對噬菌體的推廣應用至關重要。

4 新的應用

上文所論述的局限性限制了噬菌體在污水處理過程中的廣泛應用，但隨著分子生物學、生物信息學等領域的深入研究與拓展以及噬菌體展示技術等基于噬菌體的新技術的出現讓噬菌體的局限性有望得到彌補。同時，噬菌體的應用絕不僅僅局限于利用噬菌體裂解細菌這一特性。

4.1 裂解酶的發現與利用

研究者們在研究噬菌體裂解細胞的機制時發現，雙鏈DNA噬菌體能夠通過合成裂解酶來水解宿主菌細胞壁的肽聚糖結構[51]。裂解酶也稱為噬菌體編碼的內溶素，被認為是治療耐藥細菌感染的有效抗菌劑和抗生素的合適替代品，有可能克服傳統噬菌體治療的一個主要缺點，即噬菌體的狹隘特異性[52]。有報道稱[53]，宿主為革蘭氏陽性細菌的噬菌體裂解酶也能從外部溶解革蘭氏陽性細菌，其宿主范圍遠大于單個噬菌體。裂解酶作為一種抗菌劑，已經被用于各種生物醫學研究中，包括食品科學和微生物檢測。在一些動物模型中也有相關的殺菌效果的研究與評測。同時，一些臨床試驗已證明噬菌體裂解酶具有巨大的應用潛力，甚至可用于人類治療[54-55]。

從噬菌體到噬菌體裂解酶，其宿主范圍有了巨大的拓展。在未來或能發現某種廣譜裂解酶，用于殺滅某一大類絲狀菌或病原菌，從而繞過噬菌體窄譜的局限性，有效快速地滅活目標細菌。

4.2 溫和噬菌體的研究與應用

溫和噬菌體能夠通過特殊的轉導途徑介導細菌間基因轉移，存在傳播抗生素耐藥性、增強細菌毒性的風險，因此，在長久以來的噬菌體應用研究過程中，溫和噬菌體是被避免使用的。但是，測序技術和合成生物學的進展為探索利用溫和噬菌體治療細菌感染提供了新的機遇。目前，已經有不少關于溫和噬菌體的應用策略被開發并進行了試驗測試，包括降低細菌負荷、與烈性噬菌體混合以增強烈性噬菌體的裂解能力、設計基因工程噬菌體、將抗生素敏感性的基因傳遞給具有產生抗生素抗性的細菌以恢復抗菌藥物敏感性等[56]。

污水廠是抗生素污染污水的接收處，同時也是各種細菌混合滋生的聚集地。進水中殘留的抗生素與病原菌在各種處理構筑物內混合接觸，使得細菌突變產生耐藥性的幾率大大上升。此外，城市污泥存在抗性菌的可能性更高。葛峰等[57]對從南京市4個污水處理廠的活性污泥中分離出的35株細菌進行抗生素耐藥性分析，97.1%的菌株具有不同程度的抗生素耐藥性，且80%的菌株具有多重耐藥性。金明蘭等[58]在某污水廠二級處理出水中檢測出磺胺類藥物的抗性菌，這種病原菌若隨出水或污泥進入自然環境，將對環境及人體健康帶來風險。如果能夠在污水廠出水之前，利用工程溫和噬菌體使目標病原菌對抗生素恢復敏感，削弱其存活能力；或與烈性噬菌體組合以加強噬菌體的滅菌能力，則有可能從源頭解決病原菌耐藥性問題。

正如上文所述，噬菌體尾部纖維蛋白、裂解酶等噬菌體蛋白質已經在醫療、食品等諸多領域進行了試驗應用。相較于噬菌體，噬菌體蛋白質具有更寬的宿主譜以及組織滲透性。隨著噬菌體遺傳學和生物學知識的不斷深入，噬菌體和噬菌體衍生顆粒已經在醫療、診斷、細菌檢測、食品保存、動物育種和農業等領域得到了廣泛的試驗應用[59]，為噬菌體在污水處理中的應用提供了一定的試驗背景與技術手段，同時也為噬菌體在污水處理中的應用提供了新的發展方向。

5 總結

污水處理效果的好壞不僅關系到環保事業，同時也關系著每一個人的健康。污水處理工藝的改進不僅在于提高出水水質，更在于提高出水的安全性以及降低處理成本。噬菌體是一種專性侵染細菌，是能夠自體復制且快速擴散的生物制劑。長久的研究發現，在應用時，噬菌體優于抗生素，擁有巨大的應用潛力。但是，噬菌體應用目前還尚存著一些諸如特異性過強、隱含抗性或毒性基因等缺陷，使得距離噬菌體在實際中應用仍有一段距離。此外，社會問題也是噬菌體應用所必須面對的現實問題。盡管一些噬菌體制劑已經被某些官方機構承認，但是噬菌體制劑作為一種新型的生物試劑，需要更加嚴苛的管理制度，同時也需要提供更加充足的證據來證明其對人類或環境是足夠安全的。