電針對腸易激綜合征內(nèi)臟痛大鼠β內(nèi)啡肽及腦啡肽的調(diào)節(jié)作用

紀佳灝 黃作陣

摘要?目的：觀察電針對腸易激綜合征（IBS）內(nèi)臟痛大鼠血清及下丘腦β-內(nèi)啡肽（β-EP）及腦啡肽（ENK）的調(diào)節(jié)作用，探討電針對IBS內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛效應。方法：制備IBS內(nèi)臟痛大鼠模型。實驗分為模型組、電針組、假電針組和正常組。取天樞和上巨虛穴（雙側(cè)）為針刺穴位，針刺后連接電針儀;假電針組進針透皮即止，連接電針儀但不通電。模型組和正常組做與電針組相同的固定，不進行任何治療。治療后測試各組大鼠AWR評分，檢測血清及下丘腦β-EP及ENK水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠AWR評分在各個壓力梯度下均顯著升高、血清β-EP及ENK水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），下丘腦β-EP、ENK水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組、假電針組比較，電針組大鼠AWR評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;血清和下丘腦β-EP、ENK水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，假電針組大鼠AWR評分、血清和下丘腦β-EP、ENK水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：電針有效緩解IBS大鼠內(nèi)臟痛，其作用機制可能與調(diào)節(jié)血清和下丘腦β-EP、ENK的水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞?電針;腸易激綜合征;內(nèi)臟痛;大鼠;β-內(nèi)啡肽;腦啡肽;天樞;上巨虛

Abstract?Objective：To observe the regulatory effects of electroacupuncture on serum and hypothalamic β-endorphin（β-EP）and enkephalin（ENK）in rats with IBS visceral pain，and to explore the analgesic effect of electroacupuncture on IBS visceral pain.Methods：The rat model of IBS visceral pain was prepared.The experiment was divided into a model group，an electroacupuncture group，a sham electroacupuncture group and a normal group.Tianshu（S25）and Shangjuxu（S37）acupoints（both sides）was taken as acupuncture points，and the electroacupuncture instrument after acupuncture was connected.The sham electro-acupuncture group stopped when the needle was inserted through the skin，and the electro-acupuncture device was connected but not powered.The model group and the normal group received the same fixation as the electro-acupuncture group without any treatment.After treatment，the AWR scores of each group of rats were tested，and the serum and hypothalamic β-EP and ENK contents were detected by ELISA.Results：Compared with the normal group，the AWR score of the model group was significantly increased under each pressure gradient，the serum β-EP and ENK content were significantly reduced（all P<0.01），and the hypothalamic β-EP and ENK content did not change significantly（P>0.05）.Compared with the model group and the sham electroacupuncture group，the AWR score of the rats in the electroacupuncture group was significantly reduced（P<0.05）; the serum and hypothalamic β-EP and ENK levels were significantly increased（P<0.01，P<0.05）.Compared with the model group，there were no significant changes in the AWR score，serum and hypothalamic β-EP，ENK content of rats in the sham electroacupuncture group（P>0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can effectively relieve visceral pain in IBS rats，and its mechanism may be related to the regulation of the contents of β-EP and ENK in serum and hypothalamus.

Keywords?Electroacupuncture; Irritable bowel syndrome; Visceral pain; Rats; β-endorphin; Enkephalin; Tianshu（S25）; Shangjuxu（S37）

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.008

腸易激綜合征（Irritable Bowel Syndrome，IBS）是臨床常見的功能性胃腸疾病，主要癥狀包括腹痛并伴有排便習慣改變。調(diào)查顯示，我國人群IBS總患病率達到6.5%，發(fā)病高峰年齡段為30～59歲之間[1];亞洲IBS的發(fā)病率為2.9%～15.6%，全球10%～20%的人有IBS的臨床癥狀，約11%的成年人群深受其影響[2-3]。目前關(guān)于本病的發(fā)病機制尚不明確，研究認為其潛在機制主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道改變、基因易感性、內(nèi)臟高敏感性、腸道動力異常密切相關(guān)，其中尤其與內(nèi)臟高敏感性密切相關(guān)[4-5]。內(nèi)臟痛（Visceral Pain，VP）是IBS主要表現(xiàn)之一，也是眾多患者就診的主要原因之一。研究認為，外周傷害性感受器和中樞神經(jīng)元雙重敏化是導致內(nèi)臟痛的病理基礎(chǔ)[6]。既往研究顯示，針灸對IBS內(nèi)臟痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，并初步揭示了針灸治療IBS內(nèi)臟痛的作用機制[7-9]。阿片肽是一種神經(jīng)活性物質(zhì)，分為內(nèi)源性和外源性2種[10]。內(nèi)源性阿片肽是在體內(nèi)合成，目前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性阿片肽主要包括5大家族：腦啡肽、內(nèi)啡肽、強啡肽、孤啡肽和內(nèi)嗎啡肽，對疼痛具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用[11]。本研究從阿片肽物質(zhì)鎮(zhèn)痛角度，通過檢測大鼠血清和下丘腦中β-內(nèi)啡肽（β-EP）、腦啡肽（ENK）的水平變化，并進一步探討電針治療IBS內(nèi)臟痛的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?36只出生8 d SD清潔級乳鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001。所有大鼠均在北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。平均室溫（20±2）℃、平均相對濕度（60±5）%、光照周期12 h（7：00-19：00燈照，19：00-7：00黑暗）。實驗符合相關(guān)倫理學要求。

1.1.2?試劑及儀器?大鼠β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，貨號：JYM0377Ra）、大鼠腦啡肽ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，貨號：JYM0966Ra）。自制球囊;華佗牌一次性無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm）;韓式經(jīng)穴刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司，型號：HANS-100A）;血壓計（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號：水銀血壓計）;醫(yī)用三通閥（菏澤圣美高分子塑料制品有限公司）;光學顯微鏡（Olympus，日本，型號：BX53）;酶標儀（Labsystems Multiskan MS公司，芬蘭，型號：352型）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?根據(jù)Al-chaer[12]實驗方法，采用球囊刺激乳鼠直結(jié)腸（CRD）制備IBS內(nèi)臟痛大鼠模型。選擇出生8 d的乳鼠，隨機分為正常組9只和造模組27只。正常組大鼠僅進行會陰部抓揉，1次/d，連續(xù)14 d;造模組大鼠每天予以CRD刺激，方法如下：在球囊表面涂液體石蠟，從肛門緩慢插入約2 cm，到達降結(jié)腸部位。球囊充氣0.2 mL，持續(xù)1 min后緩慢撤氣，取出球囊，1 h后重復1次，1次/d，連續(xù)14 d。造模結(jié)束后，飼養(yǎng)42 d，對所有大鼠進行CRD刺激并進行腹壁撤回反射（AWR）評分。分別予以20 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、40 mm Hg、60 mm Hg、80 mm Hg的結(jié)直腸擴張刺激。每只大鼠在每個壓力梯度下重復測量3次，每次持續(xù)約20 s，2次間隔5 min，取3次均值作為最后評分值。測試結(jié)束后，隨機選取正常組1只、造模組3只大鼠進行結(jié)腸HE染色，確認造模是否成功。

1.2.2?干預方法?剩余24只造模組大鼠隨機分為模型組（MG）、電針組（EA）和假電針組（SA），每組8只。將4組大鼠進行相同的固定，電針組取天樞和上巨虛穴（雙側(cè)）進行治療，定位依據(jù)《實驗針灸學》（李忠仁主編），進針深度均為5 mm，接韓式經(jīng)穴刺激儀：疏波、頻率2 Hz、電流2 mA，30 min/次，1次/d，共7 d;假電針組進針透皮即止，連接電針儀但不通電，每次留針時間及療程同電針組;正常組及模型組大鼠不做任何治療。干預結(jié)束后對各組大鼠進行AWR評分測試。

1.2.3?取材與處理?大鼠麻醉后，取腹主動脈血液，置于離心管內(nèi)保存，待取材結(jié)束后，于4 ℃離心機內(nèi)離心提取血清，置于-80 ℃冰箱保存。于降結(jié)腸部剪取3 cm結(jié)腸組織，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定，用于HE染色及病理觀察。斷頭后，暴露大腦，取出下丘腦，置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4?檢測指標與方法?1）大鼠一般情況觀察：觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、飲食、排便、體質(zhì)量等。2）行為學檢測：AWR評分，AWR評分標準：0分：對CRD無行為反應;1分：刺激開始時大鼠偶有扭頭，CRD期間大鼠保持不動;2分：腹肌輕微收縮，無腹肌抬起;3分：腹肌強烈收縮，腹肌抬起，無盆腔及陰囊抬起;4分：身體拱起，盆腔及陰囊抬起。3）結(jié)腸組織病理學觀察：將置于4%多聚甲醛溶液中的結(jié)腸取出，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察結(jié)腸組織病理學變化。4）大鼠血清和下丘腦β-EP、ENK水平的檢測：將已制備好的血清和下丘腦提取上清液，參照說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）按試劑盒操作，測定大鼠血清和下丘腦中β-EP、ENK水平。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。對數(shù)據(jù)做正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差（±s）表示;偏態(tài)分布時采用中位數(shù)表示。正態(tài)分布組采用單因素方差分析，方差齊采用最小顯著差法（LSD）比較組間差異性;方差不齊時用Games-Howell比較組間差異性。若資料不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?實驗大鼠一般情況?正常組大鼠精神狀態(tài)良好，行動敏捷，體質(zhì)量增加，糞便軟硬適中，肛周干凈。模型組和假電針組大鼠食欲差，行動遲緩，體質(zhì)量增長緩慢，易腹瀉。電針組大鼠精神狀態(tài)、飲食、活動能力均有不同程度改善，極少腹瀉，肛周皮毛污穢減少，體質(zhì)量較模型組和假電針組明顯增加。

2.2?各組大鼠AWR評分?與正常組比較，模型組大鼠AWR評分明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，電針組大鼠AWR評分均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;假電針組大鼠AWR評分無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與假電針組比較，電針組大鼠AWR評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.3?各組大鼠結(jié)腸病理形態(tài)學觀察?各組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰，黏膜連續(xù)，腺體排列整齊、規(guī)則，無明顯炎性細胞浸潤，未見充血、水腫及潰瘍，提示結(jié)腸組織無炎性反應、損傷等改變。見圖2。

2.4?電針對IBS內(nèi)臟痛大鼠血清β-EP、ENK水平的影響?與正常組比較，模型組大鼠血清β-EP、ENK水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，電針組大鼠在經(jīng)過治療后血清β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;假電針組大鼠血清β-EP、ENK水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與假電針組比較，電針組大鼠在電針治療后血清β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.5?電針對IBS內(nèi)臟痛大鼠下丘腦β-EP、ENK水平的影響?與正常組比較，模型組大鼠下丘腦β-EP、ENK水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與模型組比較，電針組大鼠在經(jīng)過治療后β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;假電針組大鼠β-EP、ENK水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與假電針組比較，電針組大鼠在電針治療后β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3?討論

根據(jù)IBS的臨床表現(xiàn)，歸屬于中醫(yī)“腹痛、泄瀉”等疾病范疇，病因主要與外邪侵襲、飲食不節(jié)、情志內(nèi)傷等有關(guān)，病位在腸，與肝脾胃腎等臟腑密切相關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學對本病的病機尚不明確，臨床治療主要以緩解癥狀為主。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》里面就有針灸治療腹痛、泄瀉的記載，如《靈樞·邪氣藏府病形》：“飧泄，大腸痛，巨虛上廉主之”。《針灸大全》：“腹中寒痛，泄瀉不止，里急后重，天樞二穴”。上巨虛、天樞分別是大腸經(jīng)的下合穴及募穴，合募配穴，增強療效。現(xiàn)代臨床和實驗研究表明，采用天樞和上巨虛為主穴治療IBS內(nèi)臟痛療效確切，并初步闡述了針灸治療IBS內(nèi)臟痛的機制[13-15]。

Aughes于1975年首次從豬腦內(nèi)分離出具有阿片樣活性的多肽，稱之為內(nèi)源性阿片肽（EOP），簡稱內(nèi)阿片肽。EOP的發(fā)現(xiàn)極大地促進了人們對中樞和外周鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的研究。正常情況下，EOP處于靜息狀態(tài)，當機體受傷害性刺激時，脊髓背角第一神經(jīng)元末梢釋放遞質(zhì)，將痛覺傳至第二神經(jīng)元，激活EOP鎮(zhèn)痛系統(tǒng)，釋放EOP，實現(xiàn)對傳入痛覺沖動的中樞性控制[16]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展，對EOP鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的研究也逐漸加深。不斷有研究證實，EOP鎮(zhèn)痛系統(tǒng)參與多種疼痛的發(fā)聲和發(fā)展過程。如賈旺華等[17]采用電針足三里、昆侖穴研究足底切口痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用機制，結(jié)果表明電針能有效提高足底切口痛大鼠的痛閾，其作用機制可能與提高大鼠下丘腦β-內(nèi)啡肽水平有關(guān)。電針三陰交、血海能有效提高痛經(jīng)大鼠的痛閾，其作用機制可能與提高大鼠下丘腦、血清β-內(nèi)啡肽的水平密切相關(guān)[18]。電針對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應可能是通過提高大鼠下丘腦β-內(nèi)啡肽和腦啡肽水平而發(fā)揮作用，表明β-內(nèi)啡肽、腦啡肽參與疼痛發(fā)生和發(fā)展以及鎮(zhèn)痛過程[19]。內(nèi)源性阿片肽廣泛參與疼痛的過程，其參與的病種隨著研究深入逐步增加，目前基于國際較為公認的研究結(jié)論“針刺釋放內(nèi)源性阿片肽物質(zhì)”為切入點，應用蛋白互作軟件STRING，構(gòu)建了針刺阿片肽及相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，預測針刺阿片肽系統(tǒng)的潛在治療病癥，進一步擴大了針刺對阿片肽系統(tǒng)的調(diào)控作用[20]。

本研究采用球囊刺激乳鼠直結(jié)腸制備IBS內(nèi)臟痛大鼠模型，經(jīng)造模后，模型組大鼠較正常組大鼠疼痛敏感度增加，主要表現(xiàn)為對結(jié)直腸擴張（AWR）刺激反應增強。經(jīng)電針治療后，電針組大鼠AWR評分明顯下降，表明電針能有效提高IBS內(nèi)臟痛大鼠的痛閾。對各組大鼠血清和下丘腦β-EP和ENK進行檢測，電針組大鼠血清和下丘腦β-EP和ENK水平明顯升高。

綜上所述，電針對IBS內(nèi)臟痛大鼠的鎮(zhèn)痛機制之一可能通過促進外周和中樞鎮(zhèn)痛物質(zhì)（β-內(nèi)啡肽、腦啡肽）的釋放，激活EOP鎮(zhèn)痛系統(tǒng)，從而達到緩解疼痛的作用。

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（2019-03-19收稿?責任編輯：楊覺雄）