加味獨活寄生合劑對膝骨關節(jié)炎肝腎虧虛證患者血清代謝組學影響

鄺濤，張易，沈浮，盧敏，鄺高艷，黃惠勇

論著·臨床研究

加味獨活寄生合劑對膝骨關節(jié)炎肝腎虧虛證患者血清代謝組學影響

鄺濤1，張易1，沈浮1，盧敏1，鄺高艷1，黃惠勇2

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）的代謝組學方法，探討加味獨活寄生合劑對膝骨關節(jié)炎（KOA）肝腎虧虛證的療效機制。選擇25名KOA肝腎虧虛證患者，予加味獨活寄生合劑，62.5 mL/次，2次/d，口服，7 d為1個療程，共4個療程。采用GC-MS檢測患者治療前后血清，并進行多元統(tǒng)計分析。患者治療后血清中乳酸、丙氨酸、甘油、琥珀酸、葡萄糖、花生四烯酸含量明顯降低，氨基丙二酸、蘇氨酸、脯氨酸、肌醇含量明顯上升（＜0.05）；尋找到三羧酸循環(huán)、甘油酯代謝、花生四烯酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、磷酸肌醇代謝等主要代謝通路對代謝物的回調發(fā)揮了重要作用。加味獨活寄生合劑可能通過調控機體能量代謝、氨基酸代謝、脂質代謝等途徑緩解KOA肝腎虧虛證患者關節(jié)腫痛，實現(xiàn)治療效果。

加味獨活寄生合劑；膝骨關節(jié)炎；肝腎虧虛證；血清代謝組學；能量代謝；氨基酸代謝；脂質代謝

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見于中老年人的慢性疾病，目前西醫(yī)治療多以非甾體抗炎藥、關節(jié)腔注射、理療及人工關節(jié)置換手術為主[1-2]。中醫(yī)學認為，中老年人易氣血失和、肝腎虧虛，故臨床上多采用補益肝腎、調和氣血、強筋健骨及通痹止痛進行治療[3]。加味獨活寄生合劑是以《備急千金要方》獨活寄生湯為基礎，結合湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院重點專科骨傷名老專家多年臨床經驗加味而成的院內制劑[4]。當前對加味獨活寄生合劑治療KOA的研究主要集中于臨床療效評價[5-6]，對其作用機制缺少深入研究。

代謝組學從整體觀角度考察中藥復方療效，從生物標志物及代謝通路層面考察中藥復方作用機制，與傳統(tǒng)研究手段相比，代謝組學技術更適合中藥復方的藥效及作用機制研究[7]。氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）因其靈敏度高及具有已知數(shù)據(jù)庫，深受研究人員青睞，常用于中醫(yī)證候客觀化研究[8]。本研究采用GC-MS代謝組學技術檢測KOA患者經加味獨活寄生合劑治療后血清代謝組學變化，從代謝角度探討加味獨活寄生合劑治療KOA的作用機制，為臨床應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1－12月湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院住院或門診KOA患者25例。其中，男性10例，年齡42～70歲，病程1～5年；女性15例，年齡40～66歲，病程0.5～6年。本研究采用自身前后對照方法，將KOA患者藥物干預前血清作為對照組，干預后血清作為藥物組進行比較。本研究經湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院臨床倫理委員會審查批準（HN-LL-KY-2018-003-02）。

1.2 西醫(yī)診斷標準

參照《骨關節(jié)炎診斷及治療指南》[9]制定KOA西醫(yī)診斷標準。①近1個月內反復膝關節(jié)疼痛；②X線片（站立或負重位）示關節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和/或囊性變、關節(jié)緣骨贅形成；③關節(jié)液（至少2次）清亮、黏稠，白細胞＜2000個/mL；④中老年患者（≥40歲）；⑤晨僵時間≤30 min；⑥活動時有骨摩擦音/感。綜合臨床、實驗室及X線檢查，符合①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可明確診斷。

1.3 中醫(yī)辨證標準

參照《膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識（2015年版）》[10]制定肝腎虧虛辨證標準。主癥：膝關節(jié)疼痛，雙腿無力、酸軟，甚則關節(jié)腫大，活動受限；次癥：頭昏耳鳴，無力、畏寒，肢體肌肉不榮；舌脈：舌苔薄或薄白，舌紅，脈弦細。

1.4 納入標準

①符合上述西醫(yī)診斷標準及中醫(yī)辨證標準；②膝關節(jié)疼痛、腫脹處于發(fā)作期；③年齡40～80歲；④近1個月未服用任何皮質激素類藥物；⑤患者對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.5 排除標準

①因創(chuàng)傷等其他原因導致的關節(jié)炎；②治療過程中出現(xiàn)嚴重不良反應；③治療過程中服用其他藥物；④有精神障礙或重大疾病。

1.6 治療方法

加味獨活寄生合劑：獨活6 g，桑寄生18 g，制天南星6 g，黃芩6 g，木瓜12 g，威靈仙12 g，杜仲12 g，牛膝6 g，細辛3 g，秦艽6 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防風6 g，川芎6 g，黨參12 g，甘草3 g，當歸12 g，白芍10 g，熟地黃15 g。湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房根據(jù)藥物制劑標準流程制作，批號201801。62.5 mL/次，2次/d，口服。7 d為1個療程，共4個療程。

1.7 儀器與試劑

GC-MS-QP2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（日本島津）。甲氧胺（BCBP2843V）、N,O-雙（三甲基硅烷基乙酰胺）三氟乙酰胺（BSTFA，批號TS-38829）、吡啶（STBF305V）、蘋果酸（04027AEV）、2-異丙基蘋果酸（04027AEV）、脲酶（MFCD00070858）均購于Sigma公司。

1.8 血清樣本采集及處理

收集患者治療前后空腹靜脈血5 mL，1000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存，待全部樣本收集后統(tǒng)一檢測。血清樣本前處理：樣本于4 ℃下解凍1 h，取100 μL樣本，加入50 μL內標（1 mg/mL 2-異丙基蘋果酸甲醇溶液），渦旋混合；加450 μL甲醇除蛋白，渦旋混合后，靜置8 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液400 μL，氮氣溫和吹干。向干燥殘渣中加入50 μL甲氧胺-吡啶（20 mg/mL），70 ℃反應1 h。再加入100 μL BSTFA，混勻30 s，70 ℃反應1 h，室溫冷卻，樣品于1300 r/min離心8 min，取上清液100 μL移至250 μL內插管，裝入進樣瓶用于GC-MS分析檢測[11]。

1.9 氣相色譜-質譜聯(lián)用技術數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計分析

色譜柱為DB-5 MS石英毛細管（0.25 mm×30 mm，0.25 m）。進樣量1 μL，載氣為氦氣（99.99%），流速1 mL/min，分流比10∶1。柱溫70 ℃保持4 min后，以20 ℃/min升溫至110 ℃，再以8 ℃/min升溫至270 ℃，保持5 min，進樣口溫度275 ℃，電子擊離子源溫度200 ℃，溶劑延遲時間6.0 min，質譜掃描范圍35～550 m/z。

所有樣本經GC-MS檢測后，得總離子流色譜圖，利用XCMS軟件對采集到的譜圖進行峰識別、峰對齊、峰匹配和峰強度校正等操作，將結果轉化為化合物的保留時間和峰面積信息，導入SMICA14.0統(tǒng)計軟件進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。根據(jù)變量重要性投影（VIP）＞1篩選差異代謝物，利用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行檢驗，＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。采用Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca）進行代謝通路分析。

2 結果

2.1 氣相色譜-質譜聯(lián)用技術圖譜與代謝物質指認

對照組和藥物組血清樣本進行GC-MS分析，得到典型總離子流色譜圖（見圖1）。經自動質譜去卷積鑒定系統(tǒng)對總離子流色譜圖進行噪聲處理、基線校正，對其中相似度＞70%的化合物進行鑒定（見表1）。

2.2 組間代謝差異分析

PCA是一種無監(jiān)督的模式識別分析方法，可在多維空間對樣本間差異進行直觀顯示。在PCA模型中，對照組和藥物組的代謝表型有一定區(qū)分，說明二者血清代謝指紋存在差異（見圖2a）。為了更好地對二者血清代謝譜進行分型，需借助多變量模式識別方法。PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法，通過建立類別間的數(shù)學模型，使樣本間達到最大分離。建立的模型解釋能力參數(shù)R2Y、預測能力參數(shù)Q2分別為0.976、0.924，說明該模型的區(qū)分程度和預測程度均較好（見圖2b）。由圖2c可知，藥物組和對照組分布于得分圖兩側，表明經藥物干預后機體代謝存在一定變化。為驗證模型準確度，采用20個置換的置換檢驗，擬合度參數(shù)R2＝0.321和Q2＝-0.283均符合要求，進一步說明了模型可靠性（見圖2d）。

圖1 KOA患者血清樣本總離子流色譜圖

表1 KOA患者血清樣本中主要差異代謝物

序號tR/min化合物名稱變化趨勢VIP相似度/% 16.774丙酸 0.4091 26.925乳酸↓1.63*96 37.281醋酸 0.2883 47.431纈氨酸 0.1796 57.659丙氨酸↓1.70*93 67.967丁酸 0.2393 78.209乙二酸 0.6282 88.5173-羥基丁酸 0.3587 98.856異亮氨酸 0.1587 109.4202-酮異丙酸 0.5578 119.547苯乙酸 0.2992 129.899尿素 0.8793 1310.077絲氨酸 0.3690 1410.305甘油↓1.83*85 1510.673蘇氨酸↑1.96*92 1610.830甘氨酸 0.5192 1711.143琥珀酸↓1.88*82 1811.708延胡索素 0.4478 1913.493氨基丙二酸↑1.24*71 2014.460脯氨酸↑1.66*94 2114.864核糖酸 0.5782 2218.6971,2,3-丙酸 0.5183 2319.123d-四氟紅糖 0.8385 2419.374D-果糖 0.9788 2519.571甘露糖 0.3991 2619.737半乳糖 0.7387 2719.990葡萄糖↓1.85*92 2820.129葡萄糖酸 0.6186 2920.794β-半乳吡喃糖 0.2183 3021.841十五烷酸 0.4896 3122.249肌醇↑1.78*88 3223.8549,12-十八二烯酸 0.2387 3323.919油酸 0.5390 3424.224十八酸 0.7496 3526.002花生四烯酸↓1.23*84 3628.205十六酸 0.5592

注：與對照組比較，*＜0.05；↑.含量增加；↓.含量減少

注：綠色為藥物組，藍色為對照組

2.3 潛在代謝標志物確定

為篩選組間代謝差異物，采用OPLS-DA進行差異分析。OPLS-DA在PLS-DA的基礎上進一步對數(shù)據(jù)進行正交處理，通過消除組間誤差和隨機誤差，提高模型對數(shù)據(jù)的解析能力。根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值來篩選差異代謝物，并進行顯著性檢驗，符合VIP＞1且＜0.05的變量被認為與KOA有潛在關聯(lián)（見圖3）。通過HMDB數(shù)據(jù)庫對變量結構進行鑒定，各代謝物VIP值見表1。可見，KOA患者經加味獨活寄生合劑干預后，血清中乳酸、丙氨酸、甘油、琥珀酸、葡萄糖、花生四烯酸含量顯著降低，氨基丙二酸、蘇氨酸、脯氨酸及肌醇含量顯著增加（＜0.05）。

圖3 差異性標志物VIP值

2.4 代謝通路分析

差異代謝物變化常與病理條件下代謝網絡的異常息息相關，通過分析通路可闡述藥物作用機理。將鑒定所得到的血清差異代謝物進行代謝通路富集分析，見圖4。分析代謝通路可知，共涉及半乳糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，丁酸代謝，丙酮酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，氨酰tRNA生物合成等20條代謝途徑，將≤0.05且Pathway Impact＞0.1的代謝途徑作為最重要的代謝途徑，共5條：三羧酸循環(huán)（cirate cycle）、甘油酯代謝（glyceride metabolism）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、磷酸肌醇代謝（inositol phosphate metabolism）。

注：圓圈對應相關通路；圓圈顏色代表P值，P值越小，顏色越深；圓圈面積代表Pathway Impact，其值越大，面積越大

3 討論

KOA病因復雜，肥胖、炎癥、內分泌異常、免疫異常等多種因素均與其有關。本研究從代謝水平分析了加味獨活寄生合劑對KOA的療效，通過對患者血液代謝狀況進行初步探索，尋找到與該狀態(tài)密切相關的5條代謝途徑，主要集中于能量代謝、氨基酸代謝及脂質代謝。

3.1 能量代謝

膝關節(jié)軟骨、膝關節(jié)滑膜、軟骨下骨三者在力學和生物學因素共同作用下，存在降解和合成平衡[12]。隨著炎癥細胞增加，平衡被打破，引起紅腫、疼痛等一系列癥狀；而炎癥因子的增加能促進滑膜炎癥、骨性關節(jié)炎軟骨降解，抑制蛋白聚糖、軟骨膠原等合成，刺激破骨細胞活性，抑制骨細胞活性[13-14]。

炎癥因子通過抑制胰島素信號和糖酵解途徑的激活，提高血糖水平[15]。血糖升高導致外周組織胰島素抵抗及胰島功能減退，從而抑制軟骨細胞膠原合成，刺激細胞內質網應激，導致軟骨降解、退化，加速滑膜炎癥[16]。經加味獨活寄生合劑治療后，患者體內葡萄糖含量明顯降低。在炎癥損傷過程中，氧化酶由于活性下降，機體不完全氧化導致炎癥中心乳酸不斷積累。同時乳酸作為細胞轉化和自身抗原性發(fā)展的致病因子，當機體濃度升高時，生物體會出現(xiàn)酸中毒，從而誘發(fā)炎癥，導致軟骨細胞肥大[17]。

隨著炎癥因子代謝增強，機體呼吸負荷增加，導致丙酮酸代謝和三羧酸循環(huán)異常[18]。酒石酸和氨基丙二酸是丙二酸的產物，丙二酸作為競爭性抑制劑可作用于呼吸電子傳輸鏈中的琥珀酸脫氫酶，從而介導三羧酸循環(huán)[19]。經加味獨活寄生合劑治療后，患者血液中氨基丙二酸出現(xiàn)一定回調，表明藥物治療可緩解KOA能量代謝異常。

有研究表明，參與三羧酸循環(huán)的絕大多數(shù)酶位于軟骨細胞線粒體中，隨著關節(jié)炎加重，線粒體功能出現(xiàn)障礙，導致代謝紊亂和三羧酸循環(huán)中間產物異常[20]。琥珀酸為三羧酸循環(huán)的中間產物，是先天免疫信號的代謝物，在炎癥發(fā)生時可通過缺氧誘導因子1α提高白細胞介素-1β產量，放大炎癥效應[21]。經藥物干預后，琥珀酸含量在血液和尿液中含量均減少。但分析尿液中檸檬酸含量發(fā)現(xiàn)，經藥物干預后，檸檬酸含量升高[22]。作為三羧酸循環(huán)的一部分，檸檬酸代謝不僅為機體活動提供能量，還可在不同濃度下影響鈣晶體溶解度，抑制鈣晶體形成[23-25]。結合前人研究我們推斷，檸檬酸通過上調Ⅱ型膠原和骨化相關基因的表達，抑制鈣晶體的形成和生長。

3.2 氨基酸代謝

機體代謝是一個復雜、整體的生物過程，糖、脂肪、氨基酸可通過不同代謝途徑實現(xiàn)轉換，如丙氨酸可通過丙氨酸-葡萄糖循環(huán)，參與乳酸-葡萄糖循環(huán)，隨后進入三羧酸循環(huán)調節(jié)能量代謝，因此丙氨酸異常可提示氨基酸異常[26]。蘇氨酸是生酮氨基酸，與氨基酸代謝障礙關系密切，且蘇氨酸是免疫球蛋白中的一種必需氨基酸，在維持機體非特異性免疫屏障的完整中發(fā)揮重要功能[27]。精氨酸作為免疫調節(jié)劑，對機體炎癥的抑制至關重要，研究表明，精氨酸不僅可通過一氧化氮代謝途徑增強機體免疫能力，還能調節(jié)蛋白激酶信號通路抑制促炎基因表達[28-29]。脯氨酸可通過氨基酸代謝途徑與精氨酸進行轉化，提高免疫調節(jié)能力[30]。同時，脯氨酸是生物體內天然滲透壓調節(jié)劑，對維持細胞膜穩(wěn)定及提高骨細胞活性起重要作用[31]。分析給藥前后氨基酸變化，經藥物干預后，蘇氨酸、脯氨酸含量升高，抑制炎癥反應，增強機體免疫能力。

3.3 脂質代謝

甘油是三酰甘油（脂肪和油脂）和磷脂的重要組成部分，可被肝臟轉化為葡萄糖，為細胞代謝提供能量[32]。炎癥因子又抑制胰島素信號和糖酵解途徑的激活，促使脂肪動員加速，由三酰甘油形成的甘油充當?shù)诙攀拱l(fā)揮作用，而甘油水平升高又進一步誘導炎癥因子產生，加速病情進展[33]。花生四烯酸是人體必需脂肪酸，在脂加氧酶及脫水酶的作用下生成大量白三烯，參與炎癥反應[34-35]。肌醇在PI3K/AKT通路中起重要作用，通過抑制AKT激活起到抑制細胞增殖，從而改善炎癥[36]。本研究顯示，經加味獨活寄生合劑干預后，患者體內甘油、花生四烯酸含量明顯減少，肌醇含量增加。

綜上所述，本研究基于GC-MS代謝組學技術，從患者血清內源性代謝物角度，結合代謝通路調控系統(tǒng)分析了加味獨活寄生合劑治療KOA的作用機理。從血清中共篩選出10個主要的潛在生物標志物，其變化參與了機體能量代謝、氨基酸代謝和脂質代謝。經加味獨活寄生合劑治療后，機體乳酸、丙氨酸、甘油、琥珀酸、葡萄糖、花生四烯酸含量顯著降低，氨基丙二酸、蘇氨酸、脯氨酸、肌醇含量顯著增加。表明加味獨活寄生合劑對KOA的代謝紊亂具有一定調節(jié)作用，可為加味獨活寄生合劑在臨床應用和藥品研發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究基于GC-MS考察KOA患者血清代謝變化，存在一定的局限性，在后續(xù)研究中應結合多種分析技術手段，如液相色譜-質譜、核磁共振等，增加樣本量，整合蛋白組學、轉錄組學、基因組學等多組學技術對加味獨活寄生合劑對KOA的療效機制進行更深入研究。

[1] POWER J D, PERRUCCIO A V, GANDHI R, et al. Factors associated with opioid use in presurgical knee, hip, and spine osteoarthritis patients[J]. Arthritis Care Res (Hoboken),2019,71(9)：1178-1185.

[2] LAO C, LEES D, PATEL S, et al. Geographical and ethnic differences of osteoarthritis-associated hip and knee replacement surgeries in New Zealand：a population-based cross-sectional study[J]. BMJ Open,2019,9(9)：e032993.

[3] 鄺高艷,嚴可,陳國茜,等.從“虛、瘀、毒”論治膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的臨床研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2017,44(2)：334-336.

[4] 張永輝,歐梁,鄺高艷,等.加味獨活寄生合劑促進膝骨關節(jié)炎軟骨修復療效及作用機制研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2018,25(1)：28-32.

[5] 嚴可,謝佳佳,鄺高艷,等.加味獨活寄生合劑聯(lián)合股四頭肌功能鍛煉治療膝骨關節(jié)炎的臨床觀察[J].中醫(yī)藥導報,2019,25(4)：108-110.

[6] 譚開云,盧敏.加味獨活寄生合劑治療風寒濕痹、肝腎虧虛型膝骨關節(jié)炎臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥學刊,2016,34(2)：425-427.

[7] ROBERTSON D G. Metabonomics in toxicology：a review[J]. Toxicol Sci,2005,85(2)：809-822.

[8] 趙小華,何麗清,蓋江華.基于氣相色譜-質譜技術的小青龍湯證大鼠血液代謝組學研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(4)：83-86.

[9] 中華醫(yī)學會風濕病學分會.骨關節(jié)炎診斷及治療指南[J].中華風濕病學雜志,2010,14(6)：416-419.

[10] 陳衛(wèi)衡,劉獻祥,童培建,等.膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(2015年版)[J].中醫(yī)正骨,2015,27(7)：4-5.

[11] 周亞敏,肖榕,胡玉珍,等.玉竹多糖對甲亢陰虛型大鼠干預的血清代謝組學研究[J].中國藥學雜志,2017,52(14)：1263-1268.

[12] CAMPOS Y, SOLA F J, ALMIRALL A, et al. Design, construction, and biological testing of an implantable porous trilayer scaffold for repairing osteoarthritic cartilage[J]. J Tissue Eng Regen Med,2020,14(2)：355-368.

[13] 姚騰飛.加味止痛四物湯治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的療效及對血清CRP、IL-1、MMP-9水平的影響[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2019,40(1)：48-49.

[14] COURTIES A, BERENBAUM F, SELLAM J. The phenotypic approach to osteoarthritis：a look at metabolic syndrome-associated osteoarthritis[J]. Joint Bone Spine,2019,86(6)：725-730.

[15] MICKIEWICZ B, HEARD B J, CHAU J K, et al. Metabolic profiling of synovial fluid in a unilateral ovine model of anterior cruciate ligament reconstruction of the knee suggests biomarkers for early osteoarthritis[J]. J Orthop Res,2015,33(1)：71-77.

[16] NGUYEN L T, SHARMA A R, CHAKRABORTY C, et al. Review of prospects of biological fluid biomarkers in osteoarthritis[J]. Int J Mol Sci,2017,18(3)：601.

[17] WU C, LEI R, TIAINEN M, et al. Disordered glycometabolism involved in pathogenesis of Kashin-Beck disease, an endemic osteoarthritis in China[J]. Exp Cell Res,2014,326(2)：240-250.

[18] KUMAR V, KUMAR A A, JOSEPH V, et al. Untargeted metabolomics reveals alterations in metabolites of lipid metabolism and immune pathways in the serum of rats after long-term oral administration of Amalaki rasayana[J]. Mol Cell Biochem,2020,463(1/2)：147-160.

[19] MINATO Y, FASSIO S R, H?SE C C. Malonate inhibits virulence gene expression in vibrio cholerae[J]. PLoS One,2013,8(5)：e63336.

[20] HENROTIN Y, KURZ B, AIGNER T. Oxygen and reactive oxygen species in cartilage degradation：friends or foes?[J]. Osteoarthritis Cartilage,2005,13(8)：643-654.

[21] TANNAHILL G M, CURTIS A M, ADAMIK J, et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1β through HIF-1α[J]. Nature,2013,496(7444)：238-242.

[22] YAMADA S, INABA M, TSUCHIYA S, et al. The effects of acetate- free citrate-containing dialysate on calcium metabolism and fatigue in patients on maintenance hemodialysis[J]. American Journal of Clinical and Experimental Medicine,2017,5(6)：190-196.

[23] SUN Y, FRANKLIN A M, MAUERHAN D R, et al. Biological effects of phosphocitrate on osteoarthritic articular chondrocytes[J]. Open Rheumatol J,2017,11：62-74.

[24] SUN Y, MAUERHAN D R, STEUERWALD N M, et al. Expression of phosphocitrate-targeted genes in osteoarthritis menisci[J]. Biomed Res Int,2014,2014：210469.

[25] XIANG S, LI Z, BIAN Y, et al. RNA sequencing reveals the circular RNA expression profiles of osteoarthritic synovium[J]. J Cell Biochem,2019,120(10)：18031-18040.

[26] CHEN L, LUO Z, FU W, et al. Detection of urinary metabolomics before and after pringle maneuver-induced liver ischemia and reperfusion injury in rats using gas chromatography-mass spectrometry[J]. Dis Markers,2013,35(5)：345-351.

[27] 李媛,張雯霞,何盼,等.基于1H-NMR代謝組學的還貝止咳方對咳嗽變異性哮喘豚鼠的干預作用[J].中草藥,2018,49(10)：2230-2239.

[28] ZHANG H, PENG A, GUO S, et al. Dietary N-carbamylglutamate and l-arginine supplementation improves intestinal energy status in intrauterine-growth-retarded suckling lambs[J]. Food Funct, 2019,10(4)：1903-1914.

[29] FLESZAR M G, WI?NIEWSKI J, KRZYSTEK-KORPACKA M, et al. Quantitative analysis of l-arginine, dimethylated arginine derivatives, l-citrulline, and dimethylamine in human serum using liquid chromatography-mass spectrometric method[J]. Chromatographia, 2018,81(6)：911-921.

[30] ZHANG X, LI P, HUA Y, et al. Urinary metabolomics study the mechanism of Taohong Siwu Decoction intervention in acute blood stasis model rats based on liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2018,1074/1075：51-60.

[31] 榮兵,李建,賈峻,等.獨活寄生湯治療肝腎虧虛型膝骨關節(jié)炎患者臨床療效及關節(jié)液代謝組學變化[J].中國實驗方劑學雜志,2017,23(23)：159-165.

[32] WüRTZ P, WANG Q, KANGAS A J, et al. Metabolic signatures of adiposity in young adults：Mendelian randomization analysis and effects of weight change[J]. PLoS Med,2014,11(12)：e1001765.

[33] ZINI N, LISIGNOLI G, SOLIMANDO L, et al. IL1-beta and TNF-alpha induce changes in the nuclear polyphosphoinositide signalling system in osteoblasts similar to that occurring in patients with rheumatoid arthritis：an immunochemical and immunocytochemical study[J]. Histochem Cell Biol,2003,120(3)：243-250.

[34] ZIMMER J S, DYCKES D F, BERNLOHR D A, et al. Fatty acid binding proteins stabilize leukotriene A4：competition with arachidonic acid but not other lipoxygenase products[J]. J Lipid Res,2004, 45(11)：2138-2144.

[35] DUBOIS R N. Leukotriene A4 signaling, inflammation, and cancer[J]. J Natl Cancer Inst,2003,95(14)：1028-1029.

[36] DINESH P, RASOOL M. Berberine inhibits IL-21/IL-21R mediated inflammatory proliferation of fibroblast-like synoviocytes through the attenuation of PI3K/Akt signaling pathway and ameliorates IL-21 mediated osteoclastogenesis[J]. Cytokine, 2018,106：54-66.

Study on Serum Metabolomics of Knee Osteoarthritis with Liver-kidney Deficiency Syndrome Intervened byMixture

KUANG Tao1, ZHANG Yi1, SHEN Fu1, LU Min1, KUANG Gaoyan1, HUANG Huiyong2

To explore the mechanism ofMixture on knee osteoarthritis (KOA) with liver-kidney deficiency syndrome by GC-MS metabolomics methods.Totally 25 patients of KOA with liver-kidney deficiency syndrome were randomly selected and treated withMixture, 62.5 mL/time, twice a day, 7 days a course, 4 courses for oral administration. The serum of the patients before and after treatment was detected by GC-MS and the metabolic data were analyzed by multivariate statistical analysis.After the treatment ofMixture, the contents of lactate, alanine, glycerin, succinic acid, glucose and arachidonic acid in serum were significantly reduced (<0.05), and the contents of amino malonic acid, threonine, proline and inositol significantly increased (<0.05). It was found that the main metabolic pathways, such as tricarboxylic acid cycle, glyceride metabolism, arachidonic acid metabolism, starch and sucrose metabolism, inositol phosphate metabolism and so on, played an important role in the recovery of metabolites.Mixture can alleviate the joint swelling and pain of patients of KOA with liver-kidney deficiency syndrome by regulating energy metabolism, amino acid metabolism and lipid metabolism to achieve efficacy.

Mixture; knee osteoarthritis; liver-kidney deficiency syndrome; serum metabolomics; energy metabolism; amino acid metabolism; lipid metabolism

R274.94

A

1005-5304(2020)11-0023-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004087

國家自然科學基金（81874476）；國家重點研發(fā)計劃（2018YFC2002500）；第六批全國名老中醫(yī)藥專家學術經驗繼承項目（rsk-011-14）；湖南省自然科學基金（2018JJ2303、2019JJ50462）；湖南省科技廳創(chuàng)新項目（2017SK50302）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃（2015165）；湖南省衛(wèi)生健康委科研計劃（20200442）；湖南中醫(yī)藥大學校級課題（ZYYDX201726、2018XJJJ39）；湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學一流學科建設項目（2018ZYX61、2018ZYX63）

鄺高艷，E-mail：kuangyi0109@126.com

（2020-04-03）

（2020-05-16；編輯：季巍巍）