復方七芍降壓片對TNF-α誘導的與平滑肌細胞共培養的血管內皮細胞P2Y6信號通路相關因子表達的影響

劉葉倩，李弘，龔姍，陳春茗，馬丹鳳，劉林，王志琪，曾勇，王宇紅，任衛瓊

復方七芍降壓片對TNF-α誘導的與平滑肌細胞共培養的血管內皮細胞P2Y6信號通路相關因子表達的影響

劉葉倩1，李弘1，龔姍1，陳春茗1，馬丹鳳2，劉林1，王志琪3，曾勇1，王宇紅4，任衛瓊1

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南省兒童醫院，湖南 長沙 410006；3.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學科技創新中心，湖南 長沙 410208

觀察復方七芍降壓片對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導的與平滑肌細胞共培養的血管內皮細胞中炎癥因子與P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達的影響，探討其治療高血壓的機制。采用內皮細胞和平滑肌細胞構建共培養體系，利用炎癥因子TNF-α建立高血壓炎癥微環境。將共培養好的細胞隨機分為正常組、模型組、空白血清組、MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復方七芍藥物血清組、MRS2578＋復方七芍藥物血清組。MRS2578組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組加入10 μmol/L MRS2578。正常組和模型組加入等量培養液，余各組加入10%藥物血清及空白血清。采用倒置顯微鏡觀察內皮細胞和平滑肌細胞形態；采用ELISA檢測細胞上清液炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-10水平；采用免疫熒光、Western blot、RT-qPCR技術檢測內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的表達。與正常組比較，模型組和空白血清組內皮細胞和平滑肌細胞數量明顯減少，細胞輪廓不清晰，折光性降低，漂浮的死細胞團塊增多；IL-1β含量顯著增加，IL-10含量顯著減少（＜0.01）；P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強度、灰度值、mRNA水平明顯升高（＜0.01）。與模型組比較，復方七芍藥物血清組內皮細胞和平滑肌細胞折光性增強，細胞形態恢復正常；IL-1β水平明顯降低（＜0.05）；P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強度、灰度值、mRNA水平明顯降低（＜0.01）。復方七芍降壓片可明顯調控TNF-α誘導的內皮炎癥反應，改善內皮炎癥導致的平滑肌細胞損傷，維持其正常功能，其機制可能與調控內皮細胞P2Y6受體及其下游信號通路MEK1/2、ERK1/2蛋白表達，改善炎癥反應有關。

復方七芍降壓片；內皮細胞；平滑肌細胞；P2Y6-MEK1/2-ERK1/2；炎癥反應；血管重塑；大鼠

血管重塑是高血壓病最顯著的病理性特征，是引發其他靶器官損傷的共同病理基礎，也是高血壓致死的重要危險因素。高血壓作為一種慢性炎癥性疾病，炎癥在高血壓的發展進程及血管重塑的形成中扮演著極其重要的角色。嘌呤受體P2Y6是一種炎性誘導性蛋白，參與調控血管內皮炎癥反應[1]。酪氨酸激酶受體1/2（MEK1/2）、絲裂原活化蛋白激酶1/2（ERK1/2）作為促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的重要組成部分，在細胞增殖與分化過程中發揮著重要的作用[2-3]。有研究表明，炎性受體P2Y6廣泛分布于內皮細胞、平滑肌細胞、小膠質細胞等細胞中[4]，其激活后可上調MEK1/2磷酸化水平，激活ERK1/2通路，促進炎癥因子釋放，導致內皮炎癥反應的發生[5]。炎癥損傷內皮細胞后，內皮功能受損，進一步加劇炎癥反應，引起平滑肌細胞損傷，出現增殖、肥大、遷移、紊亂現象，導致血管重塑。這些證據表明，P2Y6受體介導的內皮炎癥反應可能是調控血管重塑的重要機制之一。

復方七芍降壓片具有養陰柔肝、化瘀熄風功效，為湖南中醫藥大學第一附屬醫院治療肝腎陰虛、陰虛陽亢型高血壓的經驗方。本課題組前期研究表明，該方可通過逆轉血管重塑，發揮良好的降壓作用[6]，但其作用機制是否與內皮細胞中P2Y6受體相關尚不明確。本實驗以內皮細胞和平滑肌細胞共培養體系為研究對象，探討腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導的炎癥反應狀態下內皮細胞P2Y6受體相關信號通路活化狀態與血管平滑肌細胞損傷的相關性，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物和細胞

雄性SD大鼠15只，SPF級，體質量230～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號43004700048755，動物生產許可證號SCXK（湘）2016-0002。大鼠飼養于SPF級動物房，溫度22～25 ℃、濕度50%，適應性喂養7 d。原代大鼠血管內皮細胞株（CP-R075）、平滑肌細胞株（CP-R076），Procell公司。

1.2 藥物

復方七芍降壓片（三七6 g、白芍10 g、丹參12 g、天麻10 g、葛根10 g、桑寄生10 g、杜仲10 g、甘草3 g等），湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科制備，批號20181026，規格0.46 g/片，人臨床日用量為12片，相當于原藥材97 g，蒸餾水稀釋備用；厄貝沙坦片，揚子江藥業集團北京海燕藥業有限公司，批號17122111，規格75 mg/片，成人臨床日用量為300 mg，蒸餾水稀釋備用。MRS2578，美國Selleck公司，批號S285501。

1.3 主要試劑與儀器

MEK1/2（00045687）一抗，Proteintech試劑公司；P2Y6（GR209076-11）、ERK1/2（AH10223489）、β-actin內參抗體（AH11286487）、山羊抗兔HRP二抗（AH11279138），北京博奧森生物技術有限公司；1L-1β（20190305）、IL-10（20190305）ELISA試劑盒，上海晶天生物科技有限公司；內皮細胞培養基（WH01111906SP），Procell公司。mini protean 3 cell電泳儀（BIO-RAD），MK3型酶標儀（芬蘭雷勃），K30型干式恒溫器（杭州爽盛儀器），Centrifuge 5424 R型離心機（德國Eppendorf），HI1210型水浴鍋（Leica），BCD-196TMZL型冰箱（青島Haier），Tanon-5200型全自動化學發光分析（上海天能），ULUPURE型優普特實驗室超純水（法國Millipore）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

將原代內皮細胞和平滑肌細胞分別置于37 ℃、5%CO2專用培養液中培養，隔日換液，0.25%胰酶消化傳代，調整細胞密度為1×106～5×106個/mL，按條件培養基不同分別轉種于培養瓶，用于后續實驗。

2.2 共培養體系建立

將處于對數生長期內皮細胞和平滑肌細胞用0.25%胰酶消化，調整細胞密度為1×106～5×106個/mL；將內皮細胞接種至Transwell小室孔板底部，平滑肌細胞接種至Transwell小室內側，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱內共培養1～2 d，即可成功構建內皮細胞和平滑肌細胞共培養體系[4]。

2.3 分組和給藥

共培養體系成功建立后，加入10 ng/mL TNF-α干預24 h，構建模擬高血壓炎癥微環境。并隨機分為正常組（內皮細胞＋平滑肌細胞）、模型組（內皮細胞＋平滑肌細胞＋炎癥因子）、空白血清組（內皮細胞＋平滑肌細胞＋炎癥因子＋空白血清）、MRS2578組（沉默內皮細胞＋平滑肌細胞＋炎癥因子）、厄貝沙坦藥物血清組（內皮細胞＋平滑肌細胞＋炎癥因子＋厄貝沙坦片血清）、復方七芍藥物血清組（內皮細胞＋平滑肌細胞＋炎癥因子＋復方七芍降壓片血清）和MRS2578＋復方七芍藥物血清組（沉默內皮細胞＋平滑肌細胞＋炎癥因子＋復方七芍降壓片血清）。MRS2578組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組加入10 μmol/L MRS2578。正常組和模型組加入等量培養液，其余各組加入10%藥物血清及空白血清。取實驗大鼠15只，按體質量隨機分為厄貝沙坦組、復方七芍降壓片組和空白組，每組5只，分別灌胃給予臨床等效劑量3倍的厄貝沙坦片（0.081 g/kg）、復方七芍降壓片（1.50 g/kg）和等體積蒸餾水，給藥體積10 mL/kg，每日2次，連續3 d。末次給藥后2 h，腹主動脈取血，4500 r/min離心10 min，取上清液，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即得厄貝沙坦片血清、復方七芍降壓片血清及空白血清，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 細胞形態觀察

造模干預及藥物處理24 h后，倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞、內皮細胞形態。

2.5 細胞上清液炎癥因子白細胞介素-1β、白細胞介素-10水平檢測

造模干預及藥物處理24 h后，收集細胞上清液，3000 r/min離心15 min，取上清液，ELISA檢測IL-1β、IL-10水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.6 免疫熒光檢測內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達

取培養好的細胞，移去孔內液體，冷PBS潤洗2次，4%多聚甲醛固定30 min、0.25%Triton-10作用15 min及5%BSA封閉10 min后，分別加入兔抗大鼠P2Y6、MEK1/2、ERK1/2一抗稀釋液（體積比均為1∶100），4 ℃避光孵育過夜，棄液，冷PBS潤洗4次。加入FITC標記的山羊抗兔二抗稀釋液（體積比均為1∶400），37 ℃避光孵育30 min，棄液，冷PBS潤洗4次。加入DAPI工作液，室溫避光孵育15 min，棄液，冷PBS潤洗4次，最后進行熒光檢測并拍照，并以平均熒光強度值反映各蛋白相對表達水平。

2.7 Western blot檢測內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達

從RIPA細胞裂解物中提取細胞總蛋白。用BCA法檢測蛋白含量，按4∶1比例加入5×SDS上樣緩沖液，配制10%SDS-PAGE膠電泳并轉膜至PVDF膜上（90 V，50 min），封閉液（5%脫脂奶粉）水平搖床封閉2 h，加入P2Y6、MEK1/2、ERK1/2抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜，將孵育好一抗的PVDF膜用PBST洗滌3次，5 min/次。二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，PBS洗滌后，ECL發光、顯影。TANON GIS軟件讀取各目的蛋白的條帶灰度值，以β-actin為內參計算其相對表達量。

2.8 實時熒光定量PCR檢測內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達

收集各組內皮細胞樣本，PBS漂洗3次，加入適量Trizol，充分混勻后，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液置于離心管；再移取200 μL氯仿溶液加入上清液，混勻后，渦旋15 s，離心，取上清液加入等體積異丙醇溶液，離心后留取離心管底部RNA沉淀，加入75%乙醇，離心，丟棄上清液，RNA沉淀干燥后加入20 μL RNase-free溶液，得各組mRNA，反轉錄合成cDNA，進行PCR擴增。通過Primer 5.0軟件設計引物，引物序列見表1。

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產物長度/bp P2Y6F：CGGTCATCGGCTTCTTGCTTCC120 R：CCTTGCTGCGACGCTCTTGG MEK1/2F：CAAGAAGAAGCCGACGCCCATC124 R：GTCCAGCTCCAGCTCCTCCAG ERK1/2F：GGGAGGTGGAGGTGGTGAAGG100 R：GCTGAGCTGACCATGCCGTAC β-actinF：CCCAGGCATTGCTGACAGGATG144 R：TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG

3 統計學方法

4 結果

4.1 復方七芍降壓片對內皮細胞和平滑肌細胞形態的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組內皮細胞和平滑肌細胞數量明顯減少，細胞輪廓不清晰，折光性降低，漂浮的死細胞團塊增多；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復方七芍藥物血清組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞和平滑肌細胞數量不同程度增加，且內皮細胞呈典型鋪路石樣，平滑肌細胞梭形形態恢復，折光性增強，漂浮的死細胞顯著減少，其中尤以復方七芍藥物血清組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組改善作用最明顯。結果見圖1、圖2。

4.2 復方七芍降壓片對細胞上清液炎癥因子白細胞介素-1β、白細胞介素-10水平的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組細胞上清液IL-1β水平顯著升高（＜0.01），IL-10水平明顯降低（＜0.01），表明TNF-α干預構建炎癥微環境后造成促炎因子IL-1β分泌增加，抗炎因子IL-10分泌減少；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復方七芍藥物血清組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組IL-1β水平明顯降低（＜0.05，＜0.01），MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、MRS2578＋復方七芍藥物血清組細胞上清液IL-10水平明顯升高（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復方七芍藥物血清組IL-1β水平明顯降低（＜0.05），IL-10水平升高（＞0.05）。提示MRS2578和復方七芍降壓片藥物血清均能顯著抑制炎癥微環境損傷后細胞炎癥因子IL-1β分泌增加及IL-10分泌減少，且兩者合用效果更佳。結果見圖3。

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R.MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MRS2578組比較，#P＜0.05

4.3 復方七芍降壓片對內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達的影響

免疫熒光結果顯示，與正常組比較，模型組和空白血清組內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強度明顯升高，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復方七芍藥物血清組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞P2Y6、MEK1/2熒光強度明顯降低，MRS2578組、MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞ERK1/2熒光強度明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強度降低，但差異無統計學意義（＞0.05）。提示復方七芍降壓片藥物血清在一定程度上能抑制炎癥因子誘導的內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的高表達。結果見圖4～圖7。

Western blot結果顯示，與正常組比較，模型組和空白血清組內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復方七芍藥物血清組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞P2Y6、ERK1/2蛋白表達顯著降低（＜0.01），厄貝沙坦藥物血清組、復方七芍藥物血清組內皮細胞MEK1/2蛋白表達均有降低，差異無統計學意義（＞0.05），MRS2578組、MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞MEK1/2灰度值均明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞P2Y6、ERK1/2蛋白表達均有降低，差異無統計學意義（＞0.05），MEK1/2蛋白表達明顯降低（＜0.01）。表明復方七芍降壓片藥物血清對炎癥因子誘導的內皮細胞損傷有不同程度的保護作用，且與MRS2578合用時效果更佳。結果見圖8、圖9。

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復方七芍藥物血清組

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與MRS2578組比較，##P＜0.01

4.4 復方七芍降壓片對內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達均明顯升高，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復方七芍藥物血清組和MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達均明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞P2Y6、ERK1/2 mRNA表達降低，差異無統計學意義（＞0.05），MEK1/2 mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）。表明復方七芍降壓片在一定程度上能抑制P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的mRNA表達，結果見圖10。

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與MRS2578組比較，##P＜0.01

5 討論

高血壓病屬中醫學“眩暈”“頭痛”等范疇。其病機為本虛標實，以虛證居多，責之肝腎。腎陰虧虛，肝失濡養，虛火上擾，水不涵木，陰不維陽，陰虛陽亢，肝風擾動，發為眩暈。故治以養陰柔肝、化瘀熄風之法。復方七芍降壓片以三七、白芍活血化瘀、養陰柔肝，桑寄生、杜仲補腎養肝，丹參、天麻、地龍活血熄風通絡，蘿芙木、葛根清熱生津，炒香附疏肝理氣，甘草調和諸藥，全方共奏養陰柔肝、化瘀熄風之功。現代藥理研究表明，三七、丹參具有舒張血管、降低外周阻力、改善微循環作用；天麻、地龍具有降低血漿中血管緊張素含量、減少血管活性物質分泌、調控血管緊張素-醛固酮系統功能；白芍、桑寄生、杜仲、蘿芙木、葛根可緩解平滑肌痙攣，改善血管內皮依賴性舒縮失衡，防治血管重構[7-9]。

平滑肌細胞和內皮細胞是血管壁的重要組成部分，共同維持血管正常功能，與高血壓血管重塑密切相關。平滑肌細胞是內皮細胞的周細胞之一，兩者以隙縫連接方式相互調節[10]，其中平滑肌細胞受損、增殖是導致血管重塑的重要病理過程[11]；而內皮細胞可通過分泌多種細胞因子刺激平滑肌細胞增殖、遷移，致使細胞基質中膠原纖維增多，參與心血管疾病的血管重塑[5]。正常情況下血管平滑肌處于一種靜息狀態，當炎癥因子、氧自由基等刺激因子導致內皮功能受損時，容易打破這種狀態，導致多種細胞因子、血管活性物質紊亂，引起血管平滑肌細胞結構、功能發生改變[12]。郭庶等[13]研究發現，內皮功能損傷時會引起TNF-α、IL-6等炎癥因子水平上調，激活平滑肌細胞中黏結蛋白聚糖4，促進平滑肌細胞增殖，導致血管重塑。此外，Ma等[14]認為，TNF-α通過誘導血管內皮因子的表達加重血管重塑。以上研究表明，內皮細胞損傷可引起炎癥因子分泌增加，導致血管平滑肌細胞形態損傷、結構改變、功能障礙、增殖、遷移等病理改變，誘發血管重塑。因此，研究內皮細胞對平滑肌細胞的影響，對逆轉血管重塑具有重要意義。內皮細胞-平滑肌細胞共培養模型與體內細胞間結構最為相似，有利于維持細胞間形態和功能的穩定表達，是目前用于研究內皮細胞與平滑肌細胞之間相互作用的理想模型[10]。本實驗以TNF-α構建高血壓炎癥環境，并在Transwell小室孔板底部培養內皮細胞，內側培養平滑肌細胞，觀察內皮細胞炎癥對血管平滑肌增殖、遷移的影響。

本實驗結果發現，TNF-α刺激的共培養體系中血管內皮細胞形態出現鋪路石樣的消失、細胞折光性降低，炎癥因子IL-1β水平升高、IL-10降低，并引起共培養體系中平滑肌細胞形態損傷。給藥干預后，復方七芍藥物血清組、厄貝沙坦藥物血清組、MRS2578組、MRS2578＋復方七芍藥物血清組細胞形態呈不同程度恢復正常，折光率增高，炎癥因子IL-1β水平下降，IL-10水平升高，以MRS2578＋復方七芍藥物血清組效果最為顯著。說明復方七芍降壓片藥物血清能改善炎癥因子TNF-α誘導的內皮細胞及平滑肌細胞的形態損傷，抑制細胞上清液IL-1β、升高IL-10水平。

嘌呤受體P2Y6屬G蛋白偶聯受體家族成員，在內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等均有表達；內皮細胞P2Y6受體經脂多糖或TNF-α刺激，呈現高表達，誘導炎癥因子IL-8和血管細胞黏附分子-1分泌，導致血管內皮細胞炎癥的發生[15]。與Gq/11蛋白偶聯后，可使MEK1/2蛋白活化，進而激活ERK1/2，調控炎癥相關因子的表達[16]。ERK1/2作為細胞增殖和分化的主要途徑[17]，磷酸化水平升高，可誘導多種炎癥因子釋放，血管平滑肌增殖、遷移，引發病理性血管重塑[18]。趙京山等[19]發現，羥基紅花黃A通過下調血管平滑肌細胞（VSMC）中的MEK-ERK1/2的活性，抑制VSMC的增殖，防治病理性血管重塑；復方七芍降壓片可通過下調腸系膜動脈中P2Y6受體表達，抑制下游信號通路（MEK1/2）/（ERK1/2）的活性，降低炎癥水平，起到改善血管重塑的作用[20]。同時，Nishimura等[21]發現，P2Y6可促進血管緊張素Ⅱ誘導的血壓升高，導致血管重構，而P2Y6拮抗劑通過抑制血管平滑肌細胞的增殖，能緩解血管緊張素Ⅱ誘導的血壓升高，減弱血管重構。有研究表明，MRS2578是P2Y6受體拮抗劑，可通過阻斷TNF-α誘導的內皮細胞炎癥反應，抑制血管平滑肌細胞的增殖，改善血管重塑；P2Y6受體激動劑UDP可刺激P2Y6受體上調，活化MEK-ERK1/2信號通路，調控IL-8等炎癥因子的釋放，導致小腸炎癥的發生[22-24]。以上說明，內皮細胞中P2Y6受體高表達，可激活下游（MEK1/2）/（ERK1/2）信號通路，誘導炎癥反應增強，損傷平滑肌細胞，導致血管重塑的發生。

本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組和空白血清組內皮細胞P2Y6受體高表達，其下游信號通路MEK1/2、ERK1/2蛋白及mRNA表達均升高，調控的炎癥因子IL-1β含量增加、IL-10含量減少。給藥干預后，與模型組比較，復方七芍藥物血清組、厄貝沙坦藥物血清組、MRS2578組、MRS2578＋復方七芍藥物血清組內皮細胞P2Y6受體表達降低，MEK1/2、ERK1/2蛋白表達及mRNA表達降低，細胞上清液IL-1β含量減少、IL-10含量增加，以MRS2578＋復方七芍藥物血清組效果最顯著。提示復方七芍降壓片能降低內皮細胞P2Y6受體及其下游信號通路MEK1/2、ERK1/2蛋白表達，抑制炎癥因子IL-1β水平，增加IL-10含量，改善血管平滑肌細胞形態損傷。

綜上，復方七芍降壓片改善血管重塑的機制可能為調控血管內皮細胞中P2Y6受體及其下游信號通路MEK1/2、ERK1/2的蛋白表達，改善炎癥反應，保護平滑肌細胞形態、結構、功能，抑制其增殖、遷移，改善血管重塑。本實驗設計以內皮細胞炎癥引起平滑肌細胞形態損傷來研究高血壓血管重塑，缺乏對內皮細胞功能、平滑肌細胞遷移及表型轉化等誘發血管重塑重要因素的相關指標檢測，有待今后進一步研究。

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Effects of CompoundTablets on Expression of P2Y6 Signal Pathway Related Factors of Vascular Endothelial Cells Co-cultured with Smooth Muscle Cells Induced by TNF-α

LIU Yeqian1, LI Hong1, GONG Shan1, CHEN Chunming1, MA Danfeng2, LIU Lin1,WANG Zhiqi3, ZENG Yong1, WANG Yuhong4, REN Weiqiong1

To observe the effects of compoundTablets on inflammatory factors and P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 protein expressions of vascular endothelial cells co-cultured with smooth muscle cells induced by TNF-α; To explore the mechanism of compoundTablets in the treatment of hypertension.Co-culture system was established by vascular endothelial cells and smooth muscle cells, and inflammatory factor TNF-α was used to establish a microenvironment for hypertension inflammation. The cultured cells were randomly divided into normal control group, model group, blank serum control group, MRS2578 group, irbesartan tablet drug-containing serum group, compoundTablets containing serum group, and MRS2578+compoundTablets containing serum group. MRS2578 group and MRS2578+compoundTablets containing serum group were added with 10 μmol/L MRS2578, and the normal group and model group were added with the same amount of culture medium; the remaining groups were added with 10% drug-containing serum and blank serum. The morphology of endothelial cells and smooth muscle cells were observed using an inverted microscope; IL-1β and IL-10 levels of inflammatory factors in cell supernatant were detected by ELISA; immunofluorescence, Western blot and RT-qPCR were used to detect the expressions of P2Y6, MEK1/2 and ERK1/2 in endothelial cells.Compared with the normal control group, the number of vascular endothelial cells and smooth muscle cells in the model group and the blank serum control group was significantly reduced, the cell outline was not clear and the refractive index was reduced, and the number of floating dead cells increased; the level of IL-1β increased significantly and IL-10 decreased significantly (<0.01); P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 fluorescence intensity, gray value and mRNA levels increased significantly (<0.01). Compared with the model group, the refraction of endothelial cells and smooth muscle cells increased, and the cell morphology returned to normal in compoundTablets containing serum group; the level of IL-1β decreased significantly; P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 fluorescence intensity, gray value and mRNA levels decreased significantly (<0.01).CompoundTablets can obviously regulate TNF-α-induced endothelial inflammatory response, improve the injury of smooth muscle cells caused by endothelial inflammation, and maintain its normal function. The mechanism may be related to the regulation of protein expression of P2Y6 receptor and its downstream signaling pathways MEK1/2 and ERK1/2 in endothelial cells and improvement of the inflammatory response.

compoundTablets; endothelial cell; smooth muscle cell; P2Y6-MEK1/2-ERK1/2; inflammation; vascular remodelin; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)11-0058-08

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004401

國家自然科學基金（81473616）；湖南省中醫藥管理局重點項目（201910）；湖南省科技廳項目（2018SK51203）；中醫內科重大疾病防治及轉化教育部重點實驗室開放基金（ZYNK201703）；湖南中醫藥大學研究生校級創新課題（2019CX67）

任衛瓊，E-mail：renweiqiong1@126.com

（2020-04-16）

（2020-04-28；編輯：華強）