基于網絡藥理學的桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病機制研究

辛高杰，付建華，韓笑，李磊，郭浩，孟紅旭，趙雨薇，賈飛凡，劉建勛

基于網絡藥理學的桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病機制研究

辛高杰1，付建華1，韓笑1，李磊1，郭浩1，孟紅旭1，趙雨薇1，2，賈飛凡1，劉建勛1

1.中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，北京 100091；2.濱州醫學院中西醫結合學院，山東 煙臺 264003

采用網絡藥理學方法研究活血化瘀藥桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的作用機制。采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選藥物成分及成分靶點，通過Genecards數據庫進行疾病靶點預測，利用String平臺進行蛋白相互作用（PPI）分析并構建PPI網絡，應用Cytoscape3.6.1軟件構建桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的成分-靶點-疾病網絡，利用Bioconductor中R包clusterprofile version3.14.2進行GO功能注釋和KEGG通路分析。篩選出桃仁-紅花藥對化學成分45個，作用靶點105個；PPI網絡共有節點78個，邊796條，平均度值20.41；GO分析條目共92個，包括血紅素結合、細胞因子受體結合、過氧化酶活性、生長因子受體結合等；KEGG信號通路121條，包括白細胞介素-17信號通路、T細胞受體信號通路、血管內皮生長因子信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路、核因子-κB信號通路、HIF-1信號通路等。桃仁-紅花藥對通過多靶點、多通路治療缺血性心臟病，涉及的生物學途徑可能包括炎癥、血流動力學、氧化應激、細胞凋亡、信號傳導等。

網絡藥理學；桃仁-紅花藥對；缺血性心臟??；作用機制

缺血性心臟病在心血管疾病中較為常見且危害嚴重，近年來發病率逐年升高[1]，預防和治療缺血性心臟病的手段和藥物亟待被挖掘。桃仁質重，善入里祛病位在下的瘀血，紅花質輕，可祛病位在上的瘀血，桃仁、紅花配伍通達一身上下之瘀血，治療缺血性心臟病血瘀證效果顯著，是治療本病代表方劑（桃紅四物湯、桃仁紅花煎、血府逐瘀湯、補陽還五湯等）中起活血化瘀作用的經典藥對[2-5]。但桃仁-紅花藥對成分復雜，作用機制尚未完全闡明，目前基礎研究多基于動物或離體細胞，其對人體缺血性心肌的作用機制尚不清楚，探討桃仁-紅花藥對保護人缺血心肌的具體機制有重要意義。

網絡藥理學整合系統生物學、高通量組學、網絡數據庫檢索等多學科知識和方法，具有整體性和系統性的特色，與中醫學整體觀和辨證論治特點相契合，從整體觀角度分析中藥作用的復雜網絡，為中醫藥研究提供新思路[6]。本研究利用網絡藥理學方法對桃仁-紅花藥對成分和作用靶點及缺血性心臟病蛋白靶點進行數據挖掘，將成分-靶點-疾病網絡進行可視化，構建桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病靶點的蛋白相互作用（PPI）網絡，并進一步對靶點蛋白基因和通路進行富集分析，從整體觀角度和分子層面對桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的具體機制進行研究，與已有實驗研究結果相互補充，以期探索新的作用機制，豐富活血化瘀藥對桃仁-紅花治療缺血性心臟病的科學內涵。

1 資料與方法

1.1 藥物和疾病靶點收集

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[17]收集桃仁和紅花的所有化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件篩選活性成分，并收集活性成分的作用靶點，獲得藥物靶點，構建藥物活性成分、蛋白靶點數據集。通過Genecards數據庫（https://www.genecards.org/），以“Ischemia Heart Disease”為檢索詞，檢索缺血性心臟病相關靶點，建立疾病靶點數據集。應用Uniprot數據庫對得到的藥物活性成分蛋白靶點、疾病蛋白靶點名稱進行規范化。

1.2 活性成分-靶點-疾病網絡構建

將桃仁-紅花藥對的化學成分、成分作用靶點、缺血性心臟病治療靶點進行整合，利用Cytoscape3.6.1軟件將桃仁-紅花藥對的成分靶點蛋白與缺血性心臟病靶點蛋白進行合并，用“節點”表示活性成分與作用靶點，“邊”表示活性成分與作用靶點之間的關系，得到桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的“成分-靶點-疾病”網絡圖，闡釋桃仁-紅花藥對的活性成分與缺血性心臟病相關靶點之間的關系。

1.3 蛋白相互作用網絡構建

利用String平臺（https://string-db.org/），設置物種為人類（Homo sapiens）、最低相互作用閾值為0.4，構建PPI網絡圖，展示桃仁-紅花藥對作用靶點蛋白與缺血性心臟病疾病靶點蛋白之間的相互作用關系。

1.4 GO和KEGG通路富集分析

利用Bioconductor（http://www.bioconductor.org/ about/）中R包clusterprofile version3.14.2對蛋白靶點進行GO功能富集分析，繪制GO分析條目圖，研究桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的潛在靶點。對藥物化學成分作用蛋白靶點進行KEGG通路富集分析，得出PPI網絡中直接作用靶點分布的相關通路，進一步說明化學成分的靶點蛋白在信號通路中的作用。

2 結果

2.1 桃仁-紅花活性成分及缺血性心臟病靶點

通過TCMSP篩選得到與桃仁相關的化學成分23個、作用靶點20個，與紅花相關化學成分22個、作用靶點103個，將桃仁和紅花中存在靶點對應的化合物合并，即為兩藥的共有化合物。合并兩藥的相同作用靶點18個，得到作用靶點105個。通過Genecards數據庫篩選出缺血性心臟病相關靶蛋白3196個，應用Uniprot數據庫將得到的藥物活性成分蛋白靶點、疾病蛋白靶點名稱規范化后取交集，得到桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病靶點79個。

2.2 成分-靶點-疾病網絡

桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的成分-靶點-疾病網絡見圖1，包括桃仁-紅花藥對活性成分共45個，藥物與疾病交互作用靶點79個，可直觀看出藥物化學成分與疾病靶點之間的網絡關系。quercetin（槲皮素）的作用靶點最多，度值為59，kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-麥胚固醇）、luteolin（木犀草素）、baicalein（黃芩苷元）靶點度值分別為25、25、24、17，這些連接靶點較多的活性成分可能在桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病中發揮重要作用。蛋白靶點中，PTGS1（前列腺素內過氧化物合酶1）、PGR（黃體酮）、CHRM1（毒蕈堿受體）分別與15、14、9個活性成分相連。此外，該網絡中每個蛋白靶點至少有2個活性成分與之相連，每個活性成分也至少有2個作用靶點，表明桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病是多成分、多靶點的復雜網絡，與中藥作用的復雜性一致。

注：紫色三角代表活性成分，紅色圓形代表作用靶點

2.3 桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病蛋白相互作用網絡

通過String平臺得到桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病對應靶點的PPI網絡（見圖2），包括78個節點（刪除1個游離靶點）、796條邊，平均度值為20.41。一般認為，節點連接的邊數越多，其度值越高，該相互作用蛋白在網絡中的作用就越重要。該網絡中度值較高的蛋白靶點有IL6（白細胞介素-6）、ALB（血清白蛋白）、MAPK8（絲裂原活化蛋白激酶8）、EGFR（表皮生長因子受體）、VEGFA（血管內皮生長因子A），度值分別為55、52、50、49、47。

缺血性心臟病病理機制復雜，IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、EGFR等蛋白靶點是缺血性心臟病病理過程中的關鍵靶點。IL6是一種炎癥因子，與缺血性疾病發生時白細胞的浸潤等炎性病理變化密切相關[7]。VEGFA是血管內皮生長因子的一種亞型，缺血缺氧時VEGFA表達升高，誘導新生血管的形成[8]。EGFR與VEGFA作用類似，在促進血管生成、調節血流動力學等方面發揮重要作用，與血液動力學改變有關[9]?；钛鏊帉μ胰?紅花可能通過作用于這些蛋白靶點，干預缺血性心臟病發生時炎癥反應、血管新生、細胞凋亡等過程。

2.4 GO富集分析結果

對桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病涉及的79個靶點蛋白進行GO分析，得到分析條目92個，按值排序的前20位結果見圖3?？梢钥闯?，靶點蛋白涉及的基因功能包括heme binding（血紅素結合）、cytokine receptor binding（細胞因子受體結合）、antioxidant activity（抗氧化）、peroxidase activity（過氧化酶活性）、growth factor receptor binding（生長因子受體結合）等方面。

2.5 KEGG通路富集分析結果

對桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病涉及的79個靶點蛋白進行KEGG信號通路分析，得到121條信號通路，根據值和涉及的靶點基因數進行排序，前20位的通路見圖4?？梢钥闯觯胰?紅花藥對治療缺血性心臟病集中的通路主要包括以下幾方面：參與缺血性心臟病發生時炎癥反應的IL-17 signaling pathway（白細胞介素-17信號通路）、T cell receptor signaling pathway（T細胞受體信號通路）等；參與血流動力學調節的VEGF signaling pathway（血管內皮生長因子信號通路）；參與細胞惡性增殖的TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號通路）等；參與內分泌調節的相關通路Fluid shear stress and atherosclerosis（流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路）、Estrogen signaling pathway（雌激素信號通路）等；參與細胞凋亡的PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt信號通路）、MAPK signaling pathway（MAPK信號通路）、p53 signaling pathway（p53信號通路）等；參與信號傳導的NF-kappa B signaling pathway（核因子-κB信號通路）、HIF-1 signaling pathway（缺氧誘導因子-1信號通路）等。

圖3 桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病GO富集分析

圖4 桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病KEGG通路富集分析

3 討論

本研究收集桃仁-紅花藥對活性成分45個，治療缺血性心臟病蛋白靶點79個，分析結果提示桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病具有多成分、多靶點的特點，PPI網絡展示了蛋白間相互作用錯綜復雜的關系。GO富集分析得出治療缺血性心臟病涉及的基因包括血紅素結合、細胞因子受體結合、抗氧化、過氧化酶活性、生長因子受體結合等，與缺血性心臟病發生發展過程中炎性反應、免疫反應、氧化應激損傷等病理反應有關[10-12]。KEGG通路富集發現桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病相關的通路多富集在缺血性心臟病發生時的炎癥反應、血流動力學改變、細胞惡性增殖、內分泌調節、細胞凋亡調節、信號傳導等方面，缺血性心臟病病理過程中炎癥反應時白細胞的聚集、細胞的惡性增殖等病理變化與中醫“瘀”的概念相關[13]，而與信號傳導相關的通路在調節炎癥、腫瘤等方面發揮重要作用，另外，血瘀證的生成又與血流動力學的改變、血液黏稠度的升高有關[14-16]，桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病作用通路的特點與其活血化瘀功效相呼應。

綜上所述，本研究表明，桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的具體機制可能與調控炎癥因子的表達、改善血流動力學、抑制過氧化物的產生及清除內源性氧自由基、減少心肌細胞凋亡、促進血管新生等有關。研究發現，桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的具體機制可能與抗血小板聚集、減少纖維蛋白原生成、減少炎癥因子水平、減少氧自由基生成、促進血管內皮損傷修復、降糖、降血脂等有關[17-19]。本研究結果與上述實驗研究成果一致。除已有研究的基因和通路外，本研究分析得到桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病還與多種基因和通路相關，如參與細胞轉錄過程的激活轉錄因子結合、與泛素化過程相關的泛素樣蛋白連接酶結合等基因，參與炎癥反應的NF-κB信號通路等，故桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的具體機制仍有廣泛的挖掘空間[20-21]。

中藥治療缺血性心臟病具有一定優勢，其具體作用機制復雜，有待進一步深入探索。桃仁和紅花活性成分、藥理作用均不相同，在治療缺血性心臟病過程中既各司其職又相須為用，共同發揮活血化瘀作用。本研究可為桃仁-紅花藥對治療缺血性心臟病的機制研究提供參考，但中藥作用具有多成分、多靶點的復雜性，且隨著劑型和配伍的改變，藥理作用可能發生相應的變化，本研究所得結果存在一定的局限性，仍需不斷完善。

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Study on Mechanism of Drug Pair Persicae Semen - Carthami Flos in Treatment of Ischemic Heart Disease Based on Network Pharmacology

XIN Gaojie1, FU Jianhua1, HAN Xiao1, LI Lei1, GUO Hao1, MENG Hongxu1,ZHAO Yuwei1,2, JIA Feifan1, LIU Jianxun1

To explore the mechanism of treating ischemic heart disease with the promoting blood circulation and reducing blood stasis drug pair Persicae Semen - Carthami Flos based on network pharmacology.The chemical components and targets of Persicae Semen and Carthami Flos were screened by searching the TCMSP. Genecards database was used to predict disease targets, String platform was used to analyze protein-protein interactions (PPI), and PPI network was built. The component-target-disease network of Persicae Semen - Carthami Flos drug pair for treating ischemic heart disease was constructed using Cytoscape3.6.1 software. GO function annotation and KEGG pathway analysis were performed using R package clusterprofile version 3.14.2 in Bioconductor.A total of 45 chemical components and 105 targets were identified from Persicae Semen - Carthami Flos drug pair. There were 78 nodes and 796 edges in PPI network, and the average degree value was 20.41. Totally 92 GO analysis items were obtained, including heme binding, cytokine receptor binding, peroxidase activity, growth factor receptor binding, etc.; 121 KEGG signaling pathways were obtained, including interleukin-17 signaling pathway, T cell receptor signaling pathway, VEGF signaling pathway, TNF signaling pathway, fluid shear stress and atherosclerotic signaling pathway, AGE-RAGE in diabetes complications signaling pathway, estrogen signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, MAPK signaling pathway, p53 signaling pathway, NF-κB signaling pathway, HIF-1 signaling pathway, etc.Persicae Semen - Carthami Flos drug pair treats ischemic heart disease through multiple targets and multiple pathways. The biological pathways involved may include inflammation, hemodynamics, oxidative stress, apoptosis, signal transmission, etc.

network pharmacology; Persicae Semen - Carthami Flos drug pair; ischemic heart disease; action mechanism

R259.41；R285

A

1005-5304(2020)11-0106-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.201911417

國家自然科學基金（81774145）；國家重點基礎研究發展計劃（2015CB554406）；國家科技重大專項－重大新藥創制（2018ZX09721003-009-022）

付建華，E-mail：jianhuaffcn@263.net

（2019-11-22）

（2020-01-10；編輯：陳靜）